医学检验中，ELISA各个操作步骤的注意要点都替你总结好了

　　ELISA 是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
　　目前已被广泛用于 生物学和医学科学 的许多领域。在 临床检验中 主要通 过抗原抗体反应 检测体液中的抗体或抗原性物质 。
　　目的
　　1、测定体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等；
　　2、测定激素，包括小分子量的甾体激素等；
　　3、测定抗生素和药物；
　　4、测定病原体抗原，HBsAg、HBeAg等；
　　5、利用纯化的抗原检测标本中的抗体，例如抗-HBs 等；
　　然而 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作 是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。
　　本文将叙述板式 ELISA各个操作步骤 的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。
　　标本的采取和保存
　　可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经 预处理 （如粪便和某些分泌物）。
　　大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。
　　在ELISA中 血浆和血清可同等应用 。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。
　　血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。
　　一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。 冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。
　　混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。
　　试剂的准备
　　按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。
　　从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。
　　试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
　　加样
　　在ELISA中一般有 3次加样步聚 ，即 加标本，加酶结合物，加底物 。
　　加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
　　加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。
　　有此测定（如 间接法ELISA ）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。
　　也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。
　　加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。
　　保温
　　在ELISA中一般有 两次 抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。
　　ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。
　　以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。
　　这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么 ELISA反应总是需要一定时间的温育 。
　　温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等 。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时， 实验表明 ，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。
　　为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。
　　保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。
　　若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。
　　无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内， 标准室温温度是指20-25℃ ，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。
　　室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。
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