文献解读国自然热点，m6A生信分析套路拿到手，8分文章不用愁

　　目前大多高分文章都是基于 生物信息分析+简单实验验证结合 ，但是我们如何得到相应的具有科学论证的因子来进行后续实验验证呢？
　　这次就给大家讲解2020年7月份发表在 Theranostics 上的文章，影响因子为8.579。
　　文章题目是 m6A RNA modification modulates PI3K/Akt/mTOR signal pathway in Gastrointestinal Cancer （m6A RNA修饰调节胃肠道肿瘤中PI3K/Akt/mTOR信号通路）。
　　文章基本原理
　　腺苷N6位点甲基化(m6A)是哺乳动物蛋白编码mRNA中最常见的RNA修饰，是一种具有多种重要生物学功能的可逆修饰。甲基转移酶(Writer)、去甲基酶(Erase)和特殊结合蛋白(Reader)是调控m6A的形成和功能的关键因素。
　　然而，m6A在胃肠道(GI)癌症中的潜在修饰机制尚不清楚。在这里，我们对9个已知的m6A 甲基转移酶(Writer)、去甲基酶(Erase)和特殊结合蛋白(Reader)进行了全面的分子分析。
　　第一步从 生信分析 来看看作者是如何通过一步步的生信分析套路得到能够改变PI3K/AKT/mTOR通路的m6A调控因子。
　　分析步骤如下：
　　1、m6A调节因子基因改变的分析
　　利用TCGA数据库研究m6A的writer、erasers和readers，包括 METTL3、METTL14、WTAP、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3 等9个RNA在GI癌症中的分布，绘制GI癌症患者(n=1727)和健康患者(n=160)中m6A调控因子RNA表达谱的热图，及其不同GI癌症类型中的表达水平。
　　从TCGA数据库中选择突变、拷贝数改变(扩增和缺失)、多重改变的病例，在cBioPortal中分析胃癌中m6A调节因子基因改变的频率。
　　结果表明YTHDF1，YTHDF3和HNRNPA2B1显示出相对较高的拷贝数扩增频率 。
　　2、总生存率（OS）分析
　　接下来，使用TCGA数据库对5个GI癌亚型中的m6A调控因子进行OS分析，这些结果加在一起表明， m6A调控因子可能对胃肠道癌症的生存有重要影响 。
　　3、STRING富集分析
　　通过STRING在线分析找出与m6A调控因子相关的蛋白，并获得相关蛋白参与的KEGG通路。之后使用DAVID在线分析了m6A调控因子在 27种人类癌症 中主要富集的KEGG通路。
　　最后获得 m6A调控因子及其相关蛋白共同参与的5条主要通路：PI3K/Akt、mTOR、FoxO、MAPK和p53通路 。
　　4、修饰位点预测和构建系统发育树
　　收集来自 TCGA 数据库中27种不同癌症类型的肿瘤患者(n= 9628)的体细胞突变和 DNA 拷贝数变异的数据，通过 cBioPortal 分析基因在主要通路上的改变频率，使用 SRAMP 预测m6A在主要通路成员mRNA序列中的修饰位点，并采用加权求和公式计算预测得分。
　　之后基于TCGA HumanMethylation450中的数据集，使用 DiseaseMeth 2.0 版本分析5条通路是否受到 DNA 甲基化的影响，然后基于核苷酸序列构建了所有基因(n=66)的系统进化树，最后结果显示在PI3K/Akt和mTOR通路上的成员以及FoxO、MAPK和p53通路成员中普遍存在非常可信的m6A位点。
　　综上所述，这些结果表明 m6A在调节PI3K/Akt/mTOR等癌症通路中发挥基础性作用 。
　　5、核苷酸的多态性（SNP）分析
　　下载GSE48037、GSE46705、GSE55572、GSE76367数据集，获得在 PI3K/AKT/mTOR 途径中相对表达升高的基因。
　　之后分析了来自1000个基因组计划数据库（AMR，EAS和EUR）中的SNP，应用m6A SNP来检测m6A位点周围变体的改变， 在AKT1、PIK3CA中发现了SNP在相同或不同的位点上干扰m6A的修饰 。
　　第二步从 实验部分  来看看作者是如何解释m6A甲基化位点能改变PI3K/AKT/mTOR通路的：
　　首先m6A-seq应用于从人胃癌细胞系（TMK1）提取纯化的RNA中，从免疫沉淀以及input control片段制备文库，并进行大规模平行测序，捕获到PI3K/Akt/mTOR通路中修饰RNA的m6A-seq。
　　再通过s -腺苷半胱氨酸(SAH)或METTL3 siRNA抑制甲基转移酶(METTL3-METTL14 complex复合物)的活性，以及用甲氯灭酸(MA)抑制去甲基化酶(FTO)的活性，验证了m6A对GI癌症中PI3K/Akt/mTOR信号通路的调控作用。
　　总结
　　作者先分析TCGA中m6A调控因子的富集情况，并对27种人类癌症的途径进行了全面分析，找到了5条主要信号通路。
　　进一步通过蛋白-蛋白相互作用、遗传系统图树、共表达和m6A位点预测等方法对m6A调控因子和5条通路进行了结构和功能研究。
　　接下来使用了两个独立的生物信息学工具MeT-DB V2.0 47和m6A SNP 50，验证了m6A在肿瘤中PI3K/Akt/mTOR通路中调控的基因。
　　得到m6A调控因子后进行实验验证，利用甲基转移酶和去甲基化酶选择性抑制剂进行体外研究，验证了m6A对靶基因的调控。
　　还对PI3K-Akt和mTOR信号通路关键成员进行了低尺度半定量磷酸化蛋白质组学分析，以分析m6A修饰或不修饰时的蛋白磷酸化情况。
　　原文链接：Zhao, Q., Zhao, Y., Hu, W., Zhang, Y., Wu, X., Lu, J., Li, M., Li, W., Wu, W., Wang, J., Du, F., Ji, H., Yang, X., Xu, Z., Wan, L., Wen, Q., Li, X., Cho, C. H., Zou, C., Shen, J., … Xiao, Z. (2020). m6A RNA modification modulates PI3K/Akt/mTOR signal pathway in Gastrointestinal Cancer. Theranostics, 10(21), 9528–9543. https://doi.org/10.7150/thno.42971
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