细菌刺激在炎症驱动骨形成中的作用

　　翻译：吴智明医生
　　审核：广州中医药大学第一附属医院 王海彬教授
　　文章所属：王海彬教授团队，转发请标明出处。
　　免疫细胞和可溶性因子调节骨骼细胞再生正常骨和形成病理性骨。细菌感染会引发免疫反应,激活特定的成骨通路,但这些通常被对骨质溶解和全身性炎症的担忧所掩盖。为了研究短时间内灭活细菌免疫受体激动因子引起的局部炎症反应是否可能导致有利的新骨形成。研究人员使用兔子进行了一系列研究。探明了胫骨髓内注入存活或灭活的细菌如何影响正常骨和病理骨的再生。灭活细菌的应用在4周以后显而易见地促进了大量的骨形成而没有引起全身的炎症反应或者活动性感染引起的骨溶解。各种各样灭活细菌的骨免疫调节作用和剂量依赖关系在后续异体陶瓷支架植入过程中得到了进一步的筛选。8周后的形态计量学测定表明相对低剂量的灭活细菌加强了异体骨诱导。此外，脂磷壁酸-细菌细胞壁派生的球样受体 (TLR) 2催化剂,被确认为一个成骨激活因素。总而言之,研究表明人们可以利用细菌刺激骨生成,这和成骨诱导信号通路协同起作用。这项研究揭示了灭活细菌、细菌抗原或者他们的类似物在骨骼生物材料学中作为骨再生免疫调节工具的广泛前景。
　　在这项研究中，研究人员首先对兔子（40只雌性新西兰白兔(12到16周大,2.5 - 3.5公斤）进行了不同的分组：首先分成在金黄色葡萄球菌细菌组（因为在既往研究中金黄色葡萄球菌引起的假体周围感染已经被证实大量地促进了新骨生成）和其他不同细菌的对照组。金黄色葡萄球菌中又细分为3个亚组，分别是：
　　1.胫骨植入金葡菌组
　　2.胫骨没有植入金葡菌组
　　3.使用了γ射线灭活的金葡菌配合金属植入物一起植入胫骨以尽可能模仿假体周围感染的模型。
　　研究人员设立其他不同细菌的对照组的目的主要在于探索是否其他γ射线灭活的革兰阴性菌和革兰阳性菌也具有和灭活金黄色葡萄球菌一样的促成骨作用。因此，这一组对照组并没有植入金属假体。这一组一共20只兔子，根据支架植入位置的不同分别分成胫骨植入组，皮下骨诱导组，肌间骨诱导组。每组之间根据植入的细菌又分为革兰阳性菌组、革兰阴性菌组和其他菌组。详细的分组可以见下图。
　　研究人员又接着做了其他研究。他们向我们介绍了金葡菌实验组的研究梗概。接着向我们介绍了他们对发现的细菌对全身炎症反应的总体情况。他们将105、105还有109的细菌数按照有金属植入和没有金属植入新西兰兔胫骨。分别在7、14、21、28天注射荧光团并且顺手称了一下体重以及取血。在第28天完成取材。结果发现有假体植入的新西兰兔在大多数情况下（除了第28天以外）体重都比没有金属假体要低。相对于术前也出现了不同程度的下降。比较令人惊讶的是，活菌组没有假体植入反而出现了体重的增长。在炎症指标方面大体上是活菌组高于死菌组。假体组略高于或基本与无假体组持平。这三组都没有出现非常严重的炎症反应。结果在意料之内的是，有假体组的菌落形成单位（CFU）明显高于无假体组。没有任何的细菌能够在皮质骨中培养生长。但是细菌壁染色依然在皮质骨中发现了残留的细菌痕迹。
　　图1
　　研究人员单独截选了细菌对照组第7天的抽血结果。在大部分炎症指标都不是很高的前提下，大肠杆菌和海洋分枝杆菌相比金葡菌有更加突出的炎症表现。
　　接下来，研究人员向我们介绍了细菌对局部骨改变的反应。研究人员使用microCT观察了胫骨。并列出了影响最小，影响最大和平均影响程度的横断面扫描图像。单纯金葡菌植入无假体并没有出现很大程度的影响波动。在3组中，活金葡菌加假体组具有最明显的成骨表现。死菌加假体组强于单纯金葡菌组。这在皮质骨孔隙率数据中得到了进一步的证实。研究人员以未干预侧腿作为对照。整体以及胫骨近端、胫骨远端均具有相近的表现。（图2a、b、c）研究人员在图d中放上了不同组胫骨的明场和荧光通道照相的叠加图片。可以看到假体组具有非常强烈的钙沉积相关的荧光信号。活菌组强于死菌组。研究人员在后续的HE染色中发现：假体组相比单纯菌植入组和对照组而言具有更加强烈的骨溶解和新骨生成反应，同样的也是活菌组强于灭活菌组。从这里我们其实可以猜想：在有金属植入的条件下，细菌能够更好地刺激兔子的骨代谢。不论是成骨还是骨转换都得到了一定程度上的加强。
　　图2
　　研究人员接下来针对其他菌种进行了针对性的研究，从microCT的结果来看，灭活的大肠杆菌对于胫骨有比较显著的增加骨量的作用，一同进行实验的灭活金黄色葡萄球菌和海洋分枝杆菌则表现不显著。从荧光染色的结果来看，灭活大肠杆菌也具有最强烈的成骨效应。
　　图3
　　研究人员在造模后的第56天取材，在对局部骨改变进行评分时发现灭活的金葡菌组具有最显著的新骨生成和骨溶解。在对骨组织的免疫细胞进行染色后发现：灭活大肠杆菌组相比灭活海洋分枝杆菌组具有更加强烈的免疫反应。
　　图4
　　为了进一步研究灭活细菌的成骨效应。研究人员在兔子皮下埋置了一个经过骨形态发生蛋白预先处理的双磷酸盐的涂层支架。在这个支架中分别放置不同的灭活的细菌然后观察支架中组织的骨量。研究发现较低剂量的灭活细菌（2✖️105和2✖️107CFU/ml）具有比BMP2更强的成骨效应。研究人员又发现了骨量与脂磷壁酸(LTA)的剂量相关性。所以在这里我们不难猜测，细菌可能是通过脂磷壁酸发挥它的成骨效应。
　　图5
　　参考文献：
　　Croes, M., M. C. Kruyt, W. Boot, B. Pouran, S. A. Pakpahan, H. Weinans, H. C. Vogely, A. C. Fluit, and J. Alblas. 2019. ＂THE ROLE OF BACTERIAL STIMULI IN INFLAMMATION-DRIVEN BONE FORMATION.＂ 37:402–19. doi: 10.22203/eCM.v037a24.