疏调学术论坛疏调气机汤HPLC指纹图谱建立及7种成分含量测定

　　黄宽，付鹏，林艾和，李蓉，夏宗霄，张艳娇，张震，范源
　　摘要 目的  建立不同产地疏调气机汤HPLC指纹图谱，结合化学模式识别技术对疏调气机汤进行质量评价，同时对其7种成分进行含量测定。 方法  Agilent Zorbax C18键合硅胶柱(250 mm×4.6 mm，5 µm)；乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱；检测波长：280 nm；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；温度：25℃，建立15批疏调气机汤HPLC指纹图谱，采用相似度评价、聚类分析、主成分分析、聚类热图和正交偏最小二乘判别分析等化学模式识别方法对不同产地疏调气机汤质量及其控制方法进行分析和评价，同时进行含量测定。 结果  建立了疏调气机汤HPLC指纹图谱，15批样品的定量指纹图谱相似度在0.963~0.999，共标定了19个共有峰，指认出芍药苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷B2等7个共有峰。15批疏调气机汤可聚为4类，S1-S3、S10聚为一类，S4-S9、S11、S12、S14聚为一类，S15聚为一类，S13聚为一类。定量分析条件方法学考察结果良好，7个成分加样回收率在93.72%～102.11%；15批样品中芍药苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷B2的质量分数分别为3.3706～8.2173、0.1123～0.2308、0.2343～0.3882、1.5538～2.6403、0.2244～0.4323、0.7516～1.7868、4.4271～9.6341 mg/g。 结论  本研究建立的HPLC指纹图谱结合化学模式识别的方法稳定、可靠、简便准确，可以更系统、全面地为疏调气机汤的质量控制评价提供依据。
　　关键词  疏调气机汤；HPLC；指纹图谱；化学模式识别；质量控制；芍药苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷B2
　　疏调气机汤是由国医大师张震教授根据行医60余年的经验积累及反复对中医药理论研究所创的名方，处方由柴胡、香附、郁金、丹参、川芎、枳壳、白芍、白术、茯苓、仙灵脾、薄荷、甘草12味药组成[1]。方中柴胡性平微寒，入肝胆经为君药。香附味辛微苦，性甘平入肝经。郁金辛开苦降，性寒利胆。仙灵脾性味辛甘温，入肝肾经。白术甘苦温，归脾胃经。香附、郁金、白术、仙灵脾四者均为臣药。丹参、川芎、枳壳、白芍、茯苓五者均为佐药。薄荷、甘草调和诸药为使药。全方具有舒肝解郁、舒畅气机、理气和血的功能[2-3]。主治肝郁不舒、气机失调等证[4]。张老创制的疏调气机汤经临床化裁用于诸多病症，取得了良好的临床疗效，具有很好的开发价值。由于中药复方成分复杂，只研究单一指标成分难以有效控制产品质量[5-6]。中药指纹图谱可以全面地反映中药的组成成分[7]，是基于多指标成分对中药进行质量控制的有效手段，使其质控指标由原有的对单一成分含量的测定上升为对整个中药内在品质的检测[8-11]，实现对中药内在质量的综合评价和整体物质的全面控制[12]，使中药质量达到稳定、可控。故本研究采用HPLC-DAD建立疏调气机汤指纹图谱，对其进行相似度评价，同时结合聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘判别分析等化学模式识别方法对15批样品进行分析，同时对芍药苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷B2这7种成分进行定量分析，为疏调气机汤的质量控制提供参考依据。
　　1 仪器和材料
　　1.1 仪器
　　Agelint 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；语路超声波清洗机(深圳市即洁超声科技有限公司)；AB265-SMETTLER TOLEDO十万分之一分析天平(Mettler-tolido international trade(Shanghai) co.LTD)。
　　1.2 材料
　　对照品：甘草苷（批号111610-201607，纯度97.7%）、阿魏酸（批号110773-200611，纯度99.6%）、柚皮素（批号110722-201815，纯度91.7%）、橙皮苷（批号110721-201818，纯度96.2%）和新橙皮苷（批号111857-201804，纯度99.4%）均购自中国食品药品检定研究院，柴胡皂苷B2（批号wkq20020703，纯度98.0%）和芍药苷（批号wkq20041008，纯度98.0%）均购自四川维克奇生物科技有限公司；无水乙醇（天津市优谱化学试剂有限公司）；流动相乙腈、甲醇为色谱醇；其余试剂均为分析纯；水为超纯水；15批疏调气机汤中12味药材均由云南新世纪中药饮片有限公司提供，详细信息见表1。
　　表1 15批疏调气机汤原药材来源信息
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件
　　色谱柱：Agilent Zorbax C18键合硅胶柱(250 mm×4.6 mm，5 µm)；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱：0~1 min，3% A~5% A；1~3 min，5% A~7% A；3~8 min，7% A~12% A；8~14 min，12% A~14% A；14~23 min，14% A~21% A；23~29 min，21% A~23% A；29~35 min，23% A~25% A；35~42 min，25% A~30% A；42~50 min，30% A~45% A；50~60 min，45% A~60% A；流速：1 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：25℃；进样量10 μL。
　　2.2 溶液的制备
　　2.2.1 疏调气机汤的制备
　　取柴胡、香附、郁金、丹参、川芎、枳壳、白术各10 g，白芍12 g，茯苓、仙灵脾各15 g，薄荷、甘草各6 g，加10倍量水，冷浸30min，煎煮至沸腾保持文火煮20min，趁热过滤。加8倍量水，煎煮至沸腾后保持文火煎煮20min。合并滤液，浓缩至100mL即得疏调气机汤储备液。
　　2.2.1 混合对照品溶液得制备
　　精密称取芍药苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷B2对照品适量，用甲醇溶解并稀释至刻度，配置成浓度分别为2.301、0.066、0.120、0.912、0.124、0.056、2.830 mg/mL混合对照品溶液，4℃保存，备用。
　　2.2.2 供试品溶液
　　取＂2.2.1＂项下制备得疏调气机汤储备液1mL，加甲醇定容至10mL，超声30min，静置过夜，取上清液，即得供试品溶液。
　　2.3 疏调气机汤指纹图谱方法学考察
　　2.3.1 精密度实验
　　取疏调气机汤供试品溶液（S1），按＂2.1＂项下色谱条件连续进样测定6次，记录色谱峰，以9号色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD均＜1.10％，相对峰面积的RSD均＜1.98％，表明仪器精密度良好。
　　2.3.2 稳定性试验
　　取疏调气机汤供试品溶液（S1），于室温下放置0、2、4、8、10、12、24 h，按＂2.1＂项下色谱条件进样测定，记录色谱峰，以9号色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD均＜1.04％，相对峰面积的RSD均＜1.91％，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
　　2.3.3 重复性试验
　　取疏调气机汤样品（S1）1 g，按＂2.2.2＂项下方法制备6份供试品溶液，按＂2.1＂项下色谱条件进样测定，记录色谱峰，以9号色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD均＜1.25％，相对峰面积的RSD均＜1.95％，表明该方法重复性良好
　　2.4 不同产地疏调气机汤HPLC指纹图谱建立
　　2.4.1 指纹图谱的建立及相似度评价
　　取15批疏调气机汤供试品溶液（S1~S15），按＂2.1＂项下色谱条件进样测定，记录15批疏调气机汤色谱图，将数据导入＂中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）＂进行评价，以S9号样品的色谱图为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度为0.1，得到15批疏调气机汤的HPLC指纹图谱及对照图谱，见图1。共标定19个共有峰，指认出7个色谱峰，分别是5号峰芍药苷、6号峰甘草苷、7号峰阿魏酸、9号峰柚皮苷、10号峰橙皮苷、12号峰新橙皮苷、19号峰柴胡皂苷B2。以对照指纹图谱为参照峰，15批不同产地疏调气机汤样品图谱的相似度为0.963~0.999，均在0.90以上。表明所建立的疏调气机汤指纹图谱质量稳定，可以反映其指纹特征。相似度评价结果见表2。
　　图1 混合对照品HPLC图（A）、疏调气机汤HPLC对照指纹图谱（R）和15批疏调气机汤样品HPLC图谱（S1-S15）
　　注：5：芍药苷；6：甘草苷；7：阿魏酸；9：柚皮苷；10：橙皮苷；12：新橙皮苷；19：柴胡皂苷B2
　　表2 15批样品与对照指纹图谱相似度结果
　　2.4.3 聚类分析（HAC）
　　采用SPSS 24.0统计软件以15批疏调气机汤峰面积为变量，采用组间联接法，Squared Euclidean distance聚类，对15批样品指纹图谱进行聚类分析，结果见图2。由聚类分析谱系图可知，当平方欧氏距离为5时，可将15批疏调气机汤样品可聚为4类，S1-S3、S10聚为一类，S4-S9、S11、S12、S14聚为一类，S15聚为一类，S13聚为一类。
　　图2 15批样品聚类分析树状图
　　2.4.4 主成分分析（PCA）
　　以15批疏调气机汤药材的19个共有峰的峰面积为变量，采用SPSS 24.0和SIMCA 14.1进行主成分分析，计算特征值及方差贡献率，特征值大于1的主成分有3个，累计贡献率为94.431%，结果见表3。分别以第一、第二、第三主成分来建立坐标系，进行投影即可得到各变量载荷图和所有批次的PCA投影图，见图4。色谱峰1-8、10、13、16-19在主成分1上有较高的正载荷，色谱峰9、11-12、14在主成分2上有较高的正载荷，色谱峰15在主成分3上有较高的正载荷。15批疏调气机汤样品分为4类，与聚类分析结果一致。见图5。
　　表3 3个主成分因子的特征值和方差贡献率
　　图4 主成分载荷图
　　图5 主成分分析得分图
　　2.4.5 正交偏最小二乘判别分析
　　将15批疏调气机汤药材样品的19个共有峰导入SIMCA 14.1统计软件进行OPLS-DA分析，得到各批次疏调气机汤样品间差异性成分，结果见图6和图7。结果发现15批样品聚为四类，与聚类分析和主成分分析结果一致。以变量投影重要度（Variable Importance for the Projection，VIP）＞1.0为筛选标准，共得到6个差异标志物，峰12、13、9、15、1、11。按照变量投影重要度值大小依次为12号峰（新橙皮苷）＞13号峰＞9号峰（柚皮苷）＞15号峰＞1号峰＞11号峰。这些成分是15批样品之间产生差异的主要原因，具有一定的标志性作用，该结果与主成分分析中载荷图的分析结果一致。为了更加全面、高效地评价药物质量，在以后对夏枯草的研究中应重点关注上述成分的质量变化。
　　图6 15批疏调气机汤样品OPLS-DA分析散点图
　　图7 15批疏调气机汤样品各成分VIP图
　　2.5 多成分含量测定
　　2.5.1 专属性试验
　　精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液（S1）各10微升，按＂2.1＂项下色谱条件分别进样。在芍药苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和柴胡皂苷B2对照品相应位置上，供试品溶液中均有相同保留时间的色谱峰出现，供试品色谱图见图8。
　　图8 疏调气机汤（S1 ）供试品溶液HPLC色谱图
　　2.5.2 线性关系考察
　　精密吸取＂2.2.2＂项下的混合对照品溶液，用倍比稀释法配制成系列混合对照品溶液，按＂2.1＂项下色谱条件分别进样测定，记录峰面积，以对照品质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果见表4。
　　表4 线性关系考察结果
　　2.5.3 精密度试验
　　精密吸取同一供试品溶液（S1），按＂2.1＂项下色谱条件连续进样6次，测定芍药苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷B2，各成分峰面积的RSD依次为1.29%、1.52%、1.61%、0.94%、1.45%、0.83%、1.79%，表明仪器精密度良好。
　　2.5.4 稳定性试验
　　精密吸取同一供试品溶液（S1），分别于0、2、4、8、10、12、24 h按＂2.1＂项下色谱条件进样，测定芍药苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷B2，各成分峰面积的RSD依次为1.24%、1.48%、1.30%、1.52%、1.67%、1.81%、1.53%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
　　2.5.5 重复性试验
　　取S1批次疏调气机汤，按＂2.2.3＂项下方法平行制备6份供试品溶液，按＂2.4.1＂项下色谱条件进样，测得芍药苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷B2的平均含量RSD分别为1.02%、1.82%、2.0%、1.12%、1.74%、1.92%、2.0%，表明该方法重复性良好。
　　2.5.6 加样回收率试验
　　精密吸取已知含量的疏调气机汤储备液（S1）6份，每份1 mL，加入质量浓度分别为4.257、0.141、0.290、2.770、0.278、1.552、5.887 mg/mL的芍药苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷B2混合对照品溶液1 mL，按＂2.2.2＂项下制备供试品溶液，按＂2.1＂项下色谱条件进样，计算芍药苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷B2的平均加样回收率，结果分别为100.09%、93.72%、95.70%、102.11%、99.45%、98.10%、101.03%，RSD分别为1.50%、1.01%、1.95%、1.06%、1.32%、1.91%、1.27%。
　　2.5.7 样品含量测定
　　取15批疏调气机汤供试品溶液，按＂2.1＂项下色谱条件进样测定，计算芍药苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷B2的质量分数，结果见表5。结果表明，15批样品中芍药苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷B2的质量分数依次为3.3706～8.2173、0.1123～0.2308、0.2343～0.3882、1.5538～2.6403、0.2244～0.4323、0.7516～1.7868、4.4271～9.6341 mg/g，其中芍药苷、柚皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷等成分含量较高，不同批次间各成分含量存在差异，主要受原药材质量的影响。
　　表5 15批疏调气机汤中7种成分质量分数
　　3 讨论与结论
　　3.1 色谱条件优化
　　通过考察甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈⁃0.1%磷酸水溶液等流动相体系对色谱峰的影响，发现乙腈⁃0.1%磷酸为流动相时色谱峰的分离效果较好，峰数量较多且峰形好。通过考察不同流速（0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min）、柱温（25、30、35、40℃）等对色谱峰的影响，确定选择流速为1.0 mL/min，柱温为30℃。
　　3.2 供试品溶液制备方法优化
　　本实验根据疏调气机汤在临床上的使用方法，对药材采用水煎煮提取。结合文献[13-14]，故采用上述供试品溶液制备方法，有利于提高有效成分的煎出率。
　　3.3 结论
　　国内目前对经方、名方的指纹图谱分析相对较少，本研究首创了疏调气机汤的指纹图谱研究，采用指纹图谱软件共标定出11个峰，相似度均大于0.900，说明建立的指纹图谱具有较好的稳定性和可控性。聚类分析和PCA结果基本一致，与相似度评价结果互为验证，能为其质量评价提供依据。指纹图谱经过和对照品的比对，7个峰的物质成分得到确认，5号峰为芍药苷、6号峰为甘草苷、7号峰阿魏酸、9号峰为柚皮苷、10号峰为橙皮苷、12号峰为新橙皮苷、19号峰为柴胡皂苷B2。方法学试验表明该色谱方法同时适用于该复方中芍药苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷B2的含量测定。综上所述，本研究所建立的疏调气机汤指纹图谱准确度高，专属性强，灵敏度高，可以为疏调气机汤的质量控制提供可靠依据，有利于推进国医大师张老临床用药经验的推广应用。
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