讨论基于肾阳虚证候研究制首乌对肝细胞的影响

　　近年来，我国药物性肝损害的发生率呈不断上升的趋势，据统计，我国由药物导致肝损伤患者占急性肝炎患者的10%。其中，因使用中草药而产生的肝损害甚至中毒致死的临床报道也呈逐年上升趋势。持续高发的中药肝损害事件成为医患纠纷的重要因素之一，同时也对中药安全低毒的传统认知和优势构成了巨大的挑战，给中医药的进一步发展、普及应用蒙上了阴影。一些传统并不认为具有毒性的中药，如何首乌(Polygonum multifl orum Thunb.)，陆续出现中毒致肝损伤的报道。何首乌经过炮制后具有补益精血、固肾乌须之功，为传统滋补肾阴的代表性药物之一，虽已发现其所含的蒽醌类、鞣质等均有一定的肝毒性，但该药物在临床中用于治疗肾阴虚证已有千余年，却未有肝损伤的报道。因此，笔者推测目前临床中制首乌导致肝损伤的发生可能与未按辨证论治原则使用药物，即药不对证有关。本文以中医证候为基础，探讨肾阳虚大鼠的制首乌含药血清对L02肝细胞的影响。
　　材料
　　1. 细胞系及培养条件
　　人正常肝细胞株L02，购自湘雅中心实验室细胞库，在含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，37 ，5%CO2及饱和湿度条件下进行常规培养，所有试验均在细胞对数生长期进行。
　　2 . 药品与试剂
　　R PMI-16 4 0完全培养基、胎牛血清、胰蛋白酶，购自美国Gi b co公司;噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)，购自美国Sigma公司;Annexin V-FITI/PI细胞凋亡检测试剂盒，购自南京凯基生物科技发展有限公司，批号：20140630;何首乌药材，购自四川成都荷花池药材市场，批号：1209341405。
　　3. 动物
　　SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量(20020)g，3月龄，购自西安交通大学实验动物中心，许可证号：SCXK(陕)2012-003，饲养于陕西中医药大学实验动物中心。饲养环境保持室温20-25 ，相对湿度40%-60%，实验动物自由进食和饮水。
　　4. 仪器
　　Cell Lab流式细胞仪，美国贝克曼公司;AE-21倒置显微镜，麦克奥迪公司;CB-150二氧化碳培养箱，德国Binder公司;DHG-9075 A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司;TGL-16G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂;EX-8080酶标仪，美国BIO-TEK公司;TS100-F倒置荧光数码显微镜，日本Nikon公司。
　　方法
　　1. 制首乌药材及水煎液的制备
　　将生何首乌按照2010年版《中华人民共和国药典》方法(清蒸法)进行炮制，随后将制首乌分别按照高、中、低浓度进行煎煮。煎煮方法为：将制首乌置于煎煮容器中，加入相当于药材量5倍的冷水浸泡60min，煮沸30min，再加入相当于药材量3倍的冷水继续煎煮，20min后，煎煮液浓缩。
　　2. 制首乌含药血清的制备
　　SD大鼠40只，随机分为4组，每组10只。其中，3组大鼠皮下注射氢化考的松，每日1次，25mg/kg，连续14d，造成肾阳虚证模型[9]，另1组为生理盐水组。随后各组分别以高(43.2g/kg)、中(21.6g/kg)、低浓度(10.8g/kg)的制首乌水煎液及0.9%氯化钠溶液灌胃，每天给药2次，连续7d，末次给药1h后乙醚麻醉大鼠，无菌条件下心脏取血，立即注入无菌管里，室温静置，待血液凝固，血清析出后，吸取上清液离心，3 000r/min，10min后再吸取上清液，即得制首乌含药血清。血清混合后，置于56 水浴中灭活30min，用0.22m微孔滤膜过滤除菌。经培养实验证实无微生物污染后，置于-20 冰箱中保存备用。
　　3. MTT法测定肝细胞线粒体功能
　　将细胞接种于培养瓶中，加入含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培养基5mL，置37 、5%CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养，镜下观察细胞贴壁生长情况。取生长状态良好的同一批传代细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用10%FBS的RPME-1640培养液将细胞重悬，以每孔103-104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积为100L，继续培养24h，使细胞同步化。各组分别加入高、中、低浓度的制首乌含药血清及正常大鼠血清(终浓度为15%)，每组6个复孔，设只加培养基的调零孔3个。置37 、5%CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养24、48h。每孔加入MTT溶液(5g/L，用PBS配制，pH=7.4)10L。继续在37 、5%CO2培养箱内培养4h，小心地将每孔的培养液吸出，加入DMSO150L，在摇床上中速摇匀10min。酶标仪490nm波长，检测各孔光吸收值(A)。
　　4. 流式细胞术(flow cytometry，FCM)测定
　　肝细胞凋亡率 取生长状态良好的同一批传代细胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化，用含10%FBS的RPMI-1640培养液重悬，以2104/mL，每孔2mL接种于6孔培养板中，继续培养24h，使细胞同步化。各组分别加入15%高、中、低浓度的制首乌含药血清培养48h，生理盐水组以生理盐水组大鼠血清代替，更换新的10%FBS+MEM培养液200L。细胞经处理到所需时间后，收集细胞，用预冷的PBS洗3次后，应用AnnexinV-PI双标试剂盒，按照试剂盒说明书要求，采用FCM及荧光显微镜分别检测和观察细胞凋亡情况。用流式细胞仪计数位于凋亡区内的细胞数量得到凋亡细胞百分率。
　　5. Annexin V-FITC/PI双染色荧光显微镜观察
　　L02肝细胞凋亡状态 取生长状态良好的同一批传代细胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化，用含10%FBS的RPMI-1640培养液重悬，接种于含盖玻片的6孔培养板中，各组分别加入15%高、中、低浓度的__制首乌含药血清培养48h，生理盐水组以生理盐水组大鼠血清代替。用PBS洗涤细胞2次，在50 0L的Binding Buffer中加入5L Annexin V-FITC，5LPropidium Iodide，混匀后滴加于盖玻片表面，使盖玻片表面均匀覆盖。避光、室温反应5min。将盖玻片倒置于载玻片上，用荧光显微镜、双色滤光片观察。
　　6. 统计学方法
　　数据统计采用SPSS 19.0软件进行分析，计量资料以x-s表示，单因素方差分析(One-way ANOVA)比较多组间的差异性，以P0.05为差异有统计学意义。结果1 . 制首乌含药血清对L 0 2肝细胞增殖的影响 见图1。与生理盐水组相比，15%肾阳虚各浓度组含药血清作用24h及48h后，均对L02肝细胞增殖有一定的抑制作用，其中，肾阳虚中、高浓度组含药血清作用48h后对L02肝细胞增殖的抑制率分别为15.23%、24.92%，与生理盐水组比较，差异显著(P0.05，P0.01)。
　　2. 制首乌含药血清对L02肝细胞凋亡率的影响
　　收集经制首乌含药血清处理后的L02肝细胞，用Annexin V-PI双标试剂盒，进行AV/PI双染后用流式细胞仪检测L02肝细胞的凋亡率。结果判定标准：Annexin V-/PI-为正常细胞，Annexin V+/PI-为早期凋亡细胞，Annexin V+/PI+为晚期凋亡细胞或坏死细胞，Annexin V-/PI+为细胞膜机械损伤的细胞。实验结果表明，各组均出现不同程度的细胞凋亡，凋亡细胞多为晚期凋亡细胞或坏死细胞。与生理盐水组相比，肾阳虚各浓度组细胞凋亡率均出现明显升高，其中，肾阳虚中、高浓度组细胞凋亡率与生理盐水组比较，差异显著(P0.01)。
　　3. 制首乌含药血清对L02肝细胞凋亡荧光染色的影响
　　双染后，正常细胞无荧光;细胞膜绿色荧光为早期凋亡细胞，细胞膜绿色荧光而细胞核红色荧光为晚期凋亡细胞，红色荧光为坏死细胞。生理盐水组中凋亡细胞较少，肾阳虚大鼠制首乌含药血清给药后，其中，肾阳虚中、高浓度组出现早期凋亡及晚期凋亡的细胞较多。
　　讨论
　　中医传统理论认为，中药的毒性是其治疗作用的基础。《景岳全书类经》云：药以治病，因毒为能，所谓毒者，因气味之有偏也 所以去人之邪气。《黄帝内经》中记载有有故无殒之说，明代医家张景岳解释道：大积大聚之故，有是故而用是药，所谓有病则病受之 非用毒药不能攻，攻亦无害，故可犯也。明确提出了有病则病受之的观点，提示在认识中药时不应孤立地去研究药物本身，而应该着眼于药物与机体的相互关系。当机体有邪气时，药物作用于病邪，表现出的是治疗作用，而当药物作用于正常机体时，所谓偏性(毒性)就有可能作用于机体本身，因此，本文在建立肾阳虚大鼠模型的基础上，来研究制首乌含药血清对L02肝细胞的影响。
　　本课题采用对大鼠注射氢化考的松的方法，建立肾阳虚模型，造模后与生理盐水组比较，肾阳虚各浓度组大鼠出现形体消瘦，体毛稀疏、脱毛，拱背，蜷曲，肢尾冷、挤卧在一起，肛温降低等表现，符合中医阳虚证的临床表现[9]。其后分别采用MTT法、流式细胞术及荧光染色观察肾阳虚证制首乌含药血清对L02肝细胞增殖及凋亡状态的影响。MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
　　FCM是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，而Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有高度的亲和性，可充当检测PS的敏感探针。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中，碘化丙啶(PI)则能透过凋亡中晚期的细胞核死细胞并使细胞核染红。因此，本文采用Annexin V结合PI染料以检测区分不同凋亡时期的细胞。
　　本实验结果显示，15%肾阳虚各浓度组含药血清作用24h及48h后，均对L02肝细胞增殖有一定的抑制作用，肾阳虚高浓度组含药血清作用48h后细胞抑制率达24.92%。肾阳虚中、高浓度组的细胞凋亡率明显升高，分别为27.54%和30.75%。Annexin V-FITC/PI荧光染色结果也显示，肾阳虚中、高浓度组出现早期凋亡及晚期凋亡的细胞明显增多。实验结果显示，制首乌肾阳虚含药血清作用于肝细胞后，肝细胞增殖的抑制率及肝细胞凋亡率均出现显著性增高，且呈剂量相关性，提示肾阳虚证为制首乌致肝损伤的靶向证候。本研究为临床上正确使用制首乌，避免不良反应的出现提供了依据，制首乌为传统的滋补肾阴的代表性药物，在临床应用时应辨证施治，避免应用于肾阳虚证候药不对证的情况出现。