骨科基础知识你知道多少之ampampquot成骨细胞ampampquot

　　原创：何琪医生
　　审核：广州中医药大学第一附属医院 王海彬教授
　　文章所属：王海彬教授团队，转发请标明出处。
　　众所周知，骨是由骨组织、骨膜、和骨髓构成。其具有支持、保护、造血及贮钙的功能。而其中的骨基质则是由大量钙化的细胞外基质和几种细胞构成。接下来，就让我们一起认识一下骨组织细胞中的成骨细胞。
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　　1. 成骨细胞是什么？
　　成骨细胞又称为骨母细胞，是形成骨组织的细胞，能合成和分泌骨基质，并参与骨的钙化，调节钙磷骨进出量。成骨细胞来源于骨祖细胞和骨髓中基质内的间充质始祖细胞。
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　　成骨细胞形态多样，其形状与功能状态有关，活跃时丰满，呈多边形、立方形、圆形甚至柱状等，而在静止期变为扁平状；成骨细胞常存在于新生骨的表面，呈单层排列。成骨细胞胞浆丰富，因含大量核糖蛋白，故呈较强的嗜碱性，HE染色为深蓝色。细胞核较大，呈圆形或椭圆形，位于胞体的一端。
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　　2. 成骨细胞的功能
　　在不同成熟时期，成骨细胞在体内表现为4种不同形态：
　　（1）前成骨细胞(preosteoblast)：前成骨细胞是成骨细胞的前体，由基质干细胞分化，处于静止状态、未被激活的成骨细胞，呈扁平状，无合成骨基质的功能。
　　（2）柱形或立方形成骨细胞(Cubic osteoblast)：是处于最活跃状态的成骨细胞，为锥形或立方形。前成骨细胞在内环境因子，特别是甲状旁腺激素（PTH）的作用下被激活，转变为柱状成骨细胞。当这类细胞增多时，类骨质的面积扩大，其厚度增加。
　　（3）中间型成骨细胞(Intermediate osteoblast)：当柱状成骨细胞合成与分泌骨基质的功能达到高峰时，其功能将逐渐跌落，细胞也逐渐变为扁平，分布在新生骨基质的表明。
　　（4）覆盖型成骨细胞（Lining osteoblast)：由中间型成骨细胞转化而来，当成骨细胞分泌完骨基质后，多数成骨细胞将自身埋于骨基质中，成为骨细胞。而部分成骨细胞恢复到静止状态，停留在新生类骨质的表面，变成扁平的覆盖型成骨细胞。覆盖型成骨细胞也称骨衬里细胞，它们具有界膜作用，分隔血管与新生的骨基质，一些营养成分、矿物质和水可通过此层从血液进入骨组织。且在适宜刺激出现时，覆盖型成骨细胞还可以被激活，执行活跃功能。
　　主要功能：
　　（1）合成与分泌骨基质的胶原和蛋白质。在成骨细胞的粗面内质网中合成胶原的前体，再转移到高尔基复合体内合成原胶原，经分泌性管泡排放到细胞外。在细胞外，原胶原转变为胶原。此外，骨细胞合成分泌多种糖蛋白和非胶原骨基质蛋白。
　　（2）参与类骨质的矿化过程。产生基质小泡(matrix vesicle)分布于附近的类骨质中。基质小泡富含碱性磷酸酶(ALP)、磷脂及针样钙盐结晶，基质小泡破裂后，作用于底物，使局部磷酸盐含量增高。磷脂与钙有很强的亲和性，钙盐结晶可成为钙化核心，导致类骨质迅速钙化。基质小泡与类骨质钙化的启动、维持和停止过程密切相关。
　　（3）分泌细胞因子如IGF（胰岛素样生长因子）、TGF（转化生长因子）和PDF（血小板源生长因子）等。
　　3. 成骨细胞的体外培养
　　据文献报道，成骨细胞的来源主要有新生动物或胚胎动物（大鼠、小鼠、鸡、兔）的颅骨及人的胚胎颅骨及松质骨。
　　成骨细胞培养方法：
　　（1）酶消化法：取新生健康大鼠（＜24h，10只左右），体积分数70%乙醇浸泡10min，揭去头顶皮肤，切下头盖骨，将头盖骨置于PBS内，清除骨膜、血管等结缔组织，用PBS冲洗2次后，用剪刀将颅骨充分剪碎（约1mm*1mm骨片），将骨片移入5mL 0.25%胰蛋白酶溶液内，37℃预消化20min，以清除纤维组织，后加入含10%胎牛血清的 DMEM 培养基终止消化，弃去消化液；将骨片移入另一含5mL 0.1%Ⅱ型胶原酶溶液内，37℃消化60min，将含细胞的消化液在室温条件下1000 r/min 离心10min，弃上清液，加入含10%胎牛血清的 DMEM培养液，制成细胞悬液，用移液器将细胞悬液移入细胞培养瓶中，放于5%CO2培养箱中培养。细胞培养过程中，常规隔天换液，并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。待细胞铺满瓶底后,吸出培养液，用 0. 25 %的胰蛋白酶消化，进行传代培养。使用第三代细胞进行实验。
　　（2）组织块法：将无菌人松质骨经PBS液冲洗后剪成1mm3大小，用PBS反复冲洗至发白，移入小瓶，加入0.25%胰蛋白酶溶液，37℃水浴中消化20min，弃消化液，剩余小块移入培养瓶，加入培养液，使小块均匀分布于瓶底。将培养瓶轻放入体积分数5% CO2培养箱中培养。静置数天，待细胞从骨块边长出后换培养液并弃骨块。每2天换液1次，并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。待细胞铺满瓶底后,吸出培养液，用 0. 25 %的胰蛋白酶消化，进行传代培养。使用第三代细胞进行实验。
　　（3）改良酶消化法：将幼兔断颈处死，无菌条件下取出颅盖骨，剔除骨膜、血管和结缔组织等后放入预冷的高倍双抗液中浸泡10min后移至培养皿加入PBS冲洗3次，然后将其切成大小约0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm的碎块置入15 mL离心管中，加入3 mL 2.5 g/L胰蛋白酶(含有0.02%EDTA)，在37 ℃预消化20 min，加入3 mL完全培养液终止消化，弃上液，组织块PBS洗3次后加入质量浓度为1 g/L的Ⅰ型胶原酶5 mL，在37 ℃水浴箱中消化40 min，期间不停摇晃离心管让组织块充分与酶接触，加5mL完全培养液终止消化，将混合悬液通过孔径为200目的细胞筛网，将未通过筛网的组织块拣出PBS冲洗3次，放入25 cm的培养皿中，加入10 mL完全培养液(含体积分数10%FBS、1%双抗的DMEM高糖培养液)，置入37 ℃、饱和湿度的体积分数5% CO2培养箱中培养，显微镜观察组织块游出细胞状况，每两三天换液1次，待细胞长满80%-90%首次传代。
　　参考文献：
　　Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation
　　and activation[J]. Nature, 2003, 423(6937):337-342.