解密mRNA的运载火箭脂质纳米颗粒递送系统

　　脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle, LNP) 作为mRNA疗法或疫苗的优选递送载体，被称为递送疫苗有效物质进入预定轨道的＂运载火箭＂，是目前最具潜力的递送载体之一。
　　LNP通常由四种脂质组成，包含  胆固醇 、  二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC) 、  可电离脂质1、2-⼆亚油酸-3-⼆甲氨基丙烷(MC3) 和  PEG化脂质 。其中，可电离脂质MC3的化学结构、PEG化脂质的稳定性以及四种脂质的比例发生微小变化都会改变LNP的性质和递送效率。另外，LNP所用脂质材料的鉴定和纯度都属于关键质量属性，与之几乎同等重要的是完整原料杂质和潜在降解物的监测和定量，所以控制这些脂质的质量和纯度非常重要。
　　液质(LC-MS)联用方法的优势
　　为了精准地分析LNP中的脂质成分，沃特世应用科学家团队开发了一套  简单、快速、常规 的液相色谱 - 质谱(LC-MS)联用方法，在符合法规要求的  waters_connect信息学平台 下运行，是脂质纳米颗粒产品开发和商业化获取脂质成分结构、组成和鉴定信息的理想选择。
　　图2. 液相色谱 - 质谱(LC-MS)联用方法
　　覆盖率、分离度、灵敏度均可兼得
　　LC-MS方法被广泛用于分离和分析不同来源的脂质，再将其归类为不同的脂质或分子类别。其中，正相色谱(NP)和亲水作用色谱(HILIC)是分离不同类别脂质的两种常用技术，而  反相色谱(RP) 则多用于分离同⼀类别但分子种类不同的脂质。
　　本研究使用  ACQUITY Premier CSH C18 RP色谱柱 分离LNP脂质成分，相比其他RP色谱柱，可提供更高的覆盖率和分离度。由于这些脂质的紫外吸光度较低，因此需要借助  ACQUITY RDa高分辨质谱检测器 来提高分析灵敏度。如图3所示：图3(A)为典型的提取离子色谱图；图3(B)则显示了四种代表性脂质的相应质谱图。DMG-PEG-2000的合并质谱图如图3(B)所示，在谱图中观察到多个电荷态（+2、+3和+4）。
　　图3. 正离子模式下的提取离子色谱图(A)和相应质谱图(B)。
　　可详细鉴定出各脂质成分信息
　　为鉴定各脂质成分，我们首先在UNIFI科学库中创建了一个  包含各种脂质化合物的自定义数据库（谱库） 。UNIFI将比较和匹配预期模拟碎片与实验得到的HRMS碎片，以进行结构表征。如果需要，可以单击蓝色图标检查每个碎片离子谱图，并将其发送到UNIFI科学库以创建包含碎⽚离⼦信息的自定义脂质LNP数据库。图4显示了采用UNIFI成分分析工作流程的样品分析结果示例，包括成分概要、色谱图和质谱图。
　　所有已鉴定脂质的结果都会显示在成分确认表或成分图中。其中  DMG-PEG-2000 以不均一的多分散聚合物形式存在，并且包含长度范围从38到50个(CH2CH2O)单元不等的PEG链。基于PEG单元的多分散性，  共鉴定出13种不同的PEG化脂质 。
　　图5. 已鉴定脂质纳米颗粒成分概要列表 (A)。
　　图6.    四种已鉴定脂质的成分图(B)。
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　　低至pg级的检测限
　　可电离脂质MC3、DSPC和DMG-PEG-2000的检测下限确定为5 pg/μL（柱上进样量25 pg），胆固醇的检测下限为250 pg/μL（柱上进样量1.25 ng）。
　　图7. 直观显示不同浓度水平下可电离脂质MC3响应的概要示例图。
　　可直观比较脂质批次差异
　　UNIFI中的二元比较功能可直接比较未知脂质样品与参比样品的分析结果。该功能可用于  生成脂质原料或目标产品的LC-MS图谱 ，并  显示为镜像对比图 ，以便区分类似产品，鉴别罕见杂质，或比较多个生产批次的脂质质量。另外，还可以使⽤该功能结合提取离⼦⾊谱图（图8A）或指定质谱图（图8C和8E）来⽐较未知样品中各脂质的丰度和参⽐样品的丰度，并显⽰为镜像对比图。图8A显示了仅在未知（即加标）样品中观察到的两个特有峰，保留时间分别为2.02 min和6.62 min，表明存在加入的DMG-PEG 2000和MC3脂质。色谱图差异图（图8B）显示了这两个仅在未知样品中鉴定出的峰。同样，图8D和图8F显示了仅在未知样品中存在的PEG和MC3。
　　图8. (A) 0.1 mg/mL Avanti牛肝脂质提取物（上图：参比样品色谱图中的成分含量）和加标有可电离脂质MC3及DMG-PEG 2000的0.1 mg/mL Avanti牛肝脂质提取物（下图：未知样品色谱图中的成分含量）的色谱图二元比较；(B) 参比样品和未知样品之间的色谱差异图（采用点到点扣除方法）；(C) DMG-PEG 2000的合并质谱图二元比较（保留时间2.02 min）；(D) 图7C中参比样品和未知样品之间的谱图差异图；(E) 可电离脂质MC3的合并质谱图二元比较（保留时间6.62 min）；(F) 图6E中参比样品和未知样品之间的谱图差异图。
　　可采用复杂样品验证
　　采用该方法分析复杂牛肝提取物，检测了所有主要的溶血磷脂、磷脂和中性脂质（图9）。结果表明，该方法可同时测定LNP组成以及LNP配制过程中因潜在降解、氧化、水解、氢化、聚集和二聚体形成而产生的任何其他杂质，证明该方法具有分析更复杂脂质的能力。
　　图9. Avanti Polar Lipids牛肝总脂质提取物的代表性正离子模式总离子色谱图。（缩写：DAG, 二酰基甘油；TAG, 甘油三酯；PC, 磷脂酰胆碱；PE, 磷脂酰乙醇胺；PG, 磷脂酰甘油；PS, 磷脂酰丝氨酸；PI, 磷脂酰肌醇；Cer, 神经酰胺；SM, 鞘磷脂；Cho, 胆固醇；CE, 胆固醇酯。）
　　总结
　　结合了  高性能表面(HPS)技术 和  BioAccord系统 开发的这种常规LC-MS方法，可  快速、简单地表征和分析出LNP成分 。DSPC、可电离脂质MC3和PEG化脂质的检出浓度为5 pg/μL，胆固醇的检出浓度为250 pg/μL。该方法可用于分析复杂的脂质提取物，不仅能检出所有主要脂质类别，还可同时分析出LNP中的四种脂质成分以及其它由合成过程、降解或原料污染产生的杂质，高效方便地应用于工艺开发和质量控制中。
　　参考文献  1. Buschmann MD, Carrasco MJ, Alishetty S, Paige M, Gabriel Alameh M, Weissman D. Nanomaterial Delivery Systems for mRNA Vaccines. Vaccines 2021, 9, 65；2. Isaac G, Munjoma N, Gethings L, Mullin L and Plumb R. Lipid Separation using UPLC with Charged Surface Hybrid Technology.Waters Application Note   720006959EN  .2020 July；3. Damen CWN, Isaac G, Langridge J, Hankemeier T, Vreeken RJ.Enhanced Lipid Isomer Separation in Human Plasma using Reversed-Phase UPLC with Ion-Mobility/High-Resolution MS Detection.J Lipid Res. 2014 55(8):1772–83；4. Mullin L, Cleland G, Graham K, Shah D, and Burgess J. Building a UNIFI Scientific Library for HRMS Screening Experiments.Waters Application Note   720004927EN  , 2014.