高渗环境对假体周围感染生物膜形成影响的实验

　　随着人工关节置换手术的日渐成熟及手术数量增加，极大改善了病人的生活质量，但术后感染也在不断增加。术后感染是人工关节置换最严重的并发症之一，一旦发生感染将给病人带来精神和经济上的巨大负担。据统计，由葡萄球菌导致的假体感染占总数的65 %.导致假体感染难以治愈的主要原因是生物膜的形成。生物膜主要由瓢附在生物或非生物体表面的细菌及其分泌的胞外瓢多糖组成。生物膜使抗生素难以到达感染部位发挥作用，为细菌生存创造有利的微环境。生物膜的形成是假体感染最为重要的致病机制，体外实验研究证实，高渗氯化钠溶液能够明显促进葡萄球菌生物膜的形成叫。面体内假体周围高渗环境对生物膜形成的影响未见报道。本研究通过建立兔关节假体感染模型，观察高渗环境对葡萄球菌生物膜形成的影响。
　　1材料与方法
　　1. 1实验材料
　　健康成年新西兰大白兔30只(购自青岛市药品检验所)，体质量2-3 kg，雌雄不限。表皮葡萄球菌ATCC3 5 984温州医学院余方友老师惠赠，有氧条件下置入酪蛋白陈大豆陈肉汤(TSB )溶液中振荡过夜(130 r/min,37 )培养。
　　1. 2实验方法
　　1.2.1假体感染动物模型的建立参照文献方法建立假体感染动物模型。每只兔于术前30 min肌注阿托品0. 5 mg，之后给予氯胺酮100 mg/kg、地西伴1 mg/ kg耳缘静脉注射麻醉。右下肢备皮，消毒铺无菌巾。取膝正中切口，长约3 cm 。骸旁内侧入路切开关节，外翻骸骨、屈膝。分别垂直于股骨及胫骨纵轴，用摆锯锯除股骨远侧及胫骨平台处的关节软骨约2 mm，克氏针垂直于内、外骼平面分别刺入股骨及胫骨骨髓腔，装入自制假体。冲洗伤口后，逐层缝合。术后肌注庆大霉素4万单位，每天3次，共3d;术后2周采集关节液经细菌培养证实为无菌状态。在兔右侧膝关节内注入1 X 10g CFU/I二表皮葡萄球菌，2d后采集关节液经细菌培养证实感染造模成功。
　　1.2.2动物分组及处理大白兔随机分为实验组和对照组。在注入细菌的同时，实验组注入40 g/I,的氯化钠溶液0. 1 mI,，随后每日注射1次;对照组注入生理盐水0. 1 mI,，也每日注射1次。于接种细菌后2,4,6,8和16 d分别处死3只兔，留取关节液、假体和感染周围组织。
　　1.2.3观察指标①关节液的细菌计数:用微量移液器吸取定量关节液连续稀释，然后将定量的稀释液接种于血琼脂培养基上，进行培养并计数细菌。②组织学观察:假体周围感染组织经常规处理后进行苏木精-伊红染色，光镜下观察炎细胞浸润情况及是否存在菌落。③扫描电镜观察:取出假体用无菌生理盐水冲洗3次，然后用30 g/I二醛固定4 h,以0. 1 mol/L磷酸缓冲液漂洗。用体积分数0. 30,0. 50,0. 70,0. 80, 1. 00乙醇溶液依次脱水，其中体积分数1. 00乙醇溶液脱水2次，每次10 min。乙酸异戊脂置换。用XI1型CO2临界点干燥器干燥,IB-3型离子镀金仪喷金镀膜，JSM-840扫描电镜观察。根据文献方法对假体表面细菌进行半定量评估。
　　1. 3统计学分析
　　采用SPSS 15. 00统计软件包进行分析，定量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验。
　　2结果
　　2.1关节液细菌计数注入细菌后2-4 d实验组和对照组关节液细菌计数差异无显著性(PLO. 05)，注入细菌后6,8和16 d两组细菌计数差异有统计学意义(t=2. 16-3. 17,P0. 05)。
　　2.2假体周围组织学观察
　　注入细菌后，实验组有2只动物、对照组有1只动物出现少量炎细胞浸润改变。注入细菌后4a，实验组所有动物假体周围组织均有中性粒细胞浸润，随后中性粒细胞浸润逐渐增多;注入细菌后可见微菌落形成。对照组注入细菌后4a开始出现炎细胞浸润，注入细菌后sa所有动物周围组织中均发现炎细胞浸润。
　　2. 3扫描电镜观察
　　注入细菌后两组假体表面均未观察到细菌瓢附;注入细菌后4a两组均观察到假体表面有少量细菌瓢附;注入细菌后6,8,16 d实验组假体表面瓢附的细菌较对照组逐渐增多，生物膜形成的能力逐渐增强。
　　3讨论
　　表皮葡萄球菌是在人体皮肤和瓢膜定居的正常菌群之一，通常情况下致病能力较低，但是随着生物材料在临床的广泛应用以及广谱抗生素大量应用导致的耐药菌的出现，使其成为临床最常见的引起内植物感染的细菌之一，表皮葡萄球菌引起感染的机制与其高生物膜形成能力有关。生物膜的形成过程分为瓢附和聚集两个阶段。当生物材料植入人体后宿主的蛋白类物质会将其包裹，表皮葡萄球菌会瓢附在表面形成生物膜，细菌瓢附于表面后分化增殖形成多层的细胞团块，产生大量的瓢液，表皮葡萄球菌藏匿于其中。表皮葡萄球菌细胞间多糖瓢附素(PIA)的合成是促进细菌聚集的主要因子叫。PIA的生成与ADBC操纵子基因密切相关，在不同环境因素的作用下通过不同途径影响ADBC操纵子的表达。KNOBLICH等研究表明，在Rsbu蛋白的参与下，环境渗透压能诱导ADBC的表达从面影响生物膜的形成。icaR基因位于ADBC操纵子的上游，是ADBC操纵子的抑制性基因，氯化钠促进表皮葡萄球菌生物膜形成的机制可能与其抑制了icaR的表达有关。
　　本实验采用临床最常见的引起假体感染的表皮葡萄球菌建立新西兰大白兔关节置换术后假体感染模型，能够较好地模拟体内的内环境变化。通过比较不同时间段的关节液细菌计数观察到，注入细菌后2-4 两组之间细菌数量差异无统计学意义，但随时间延长实验组的细菌数量明显增多，说明与体外培养一样，40 g的氯化钠溶液在体内同样有促进表皮葡萄球菌生长的作用。但是具体机制还不清楚，作者认为可能与生物膜有关:生物膜内细菌的抵抗力是浮游菌的1 000倍，同时生物膜产生后，宿主游走的淋巴细胞将无法瓢附于生物材料表面，生物膜的产生使体内局部的免疫反应呈抑制状态，有利于细菌的增殖叫。
　　组织学观察显示，实验组注入细菌后就开始出现炎细胞的浸润，面此时扫描电镜未发现细菌的瓢附。传统观点认为诊断假体感染时生物膜的特异性较高，但是本实验结果表明周围组织学的改变要早于生物膜的形成，与EKHHUIZEN等报道的结果相似。扫描电镜在注入细菌后4d发现假体表面有细菌的瓢附，在随后各时间段内实验组细菌瓢附数量要大于对照组。本文关节液细菌计数与扫描电镜结果显示，当关节液细菌数量无明显变化时，扫描电镜即显示假体表面有细菌的瓢附，说明细菌的瓢附是生物膜形成的前提条件，面氯化钠能够促进生物膜的形成。
　　综上所述，表皮葡萄球菌动物假体感染模型适合用于生物膜研究，假体周围高渗环境能够促进表皮葡萄球菌的生长以及生物膜的形成，这与体外实验结果相似。寻找能够抑制细菌生长及生物膜形成的方法来治疗假体感染成为将来研究的重点。此外，本实验只采用一种细菌作为研究对象，其结果的普遍性有待于进一步研究。