中药防治酒精性肝损伤的实验研究

　　酒精性肝损伤（alcoholic liver disease，ALD）是由于长期大量饮酒导致的肝中毒性损害，包括酒精性脂肪肝（alcoholic fattyliver，AFL）、酒精性肝炎（alcoholic hepatitis，AH）、酒精性肝纤维化（alcoholic fibrosis，AF）和酒精性肝硬化（alcoholic cirrhosis，AC）。当肝脏功能因饮酒而发生损害时，机体的其他器官很快会因营养缺乏和血液中过多的毒性物质蓄积而受到不良影响。随着我国经济的飞速发展、人民生活方式和饮食结构的改变，ALD已成为不容忽视的隐型杀手，严重威胁着人民的健康。现代医学治疗ALD除了戒酒、对症治疗外，尚无特效疗法。而中医学中虽无ALD之称，但对饮酒伤肝的认识和论述已有悠久的历史，如伤酒酒癖酒鼓酒疸等。近年来，中医学发挥其特色优势，在单味中药提取物的实验研究及临床组方的应用研究上，对防治ALD取得了一定的成果和疗效。
　　单味中药提取物的实验研究
　　随着科学技术的发展，研究人员可从单味中药中提取出纯度较高的有效物质，有针对性地进行研究。在ALD方面，比如有葛花中的黄酮类提取物、葛根中的异黄酮类及皂苷类提取物等，现列举一些研究较为成熟且有效的单味中药提取物进行论述。
　　1. 葛花 葛花为豆科植物葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi或甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的未开放花蕾，自古已有解酒醒脾之用，为当代临床常用的具有代表性的解酒药物。苗彦妮等观察葛花对大鼠ALD有预防作用，其采用酒精灌胃的方法建造大鼠ALD模型，结果表明模型组大鼠血清谷氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartatetransaminase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphate，ALP）活性较空白组显著增加，总蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）含量较空白组显著降低，且肝组织中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性显著降低，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量显著升高。而葛花醇提物组大鼠血清ALT、AST活性较模型组显著降低，TP、ALB含量较模型组显著升高，肝组织SOD活性，谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量较模型组显著升高，MDA含量显著低于模型组，说明葛花醇提取物对ALD具有预防作用。雷红伟等也通过酒精灌胃的方法复制大鼠ALD模型，进而观察葛花对大鼠ALD的保护作用，结果表明，葛花具有促进乙醇代谢，减少肝组织中MDA含量，增加肝组织中GSH活性来达到保护肝细胞的作用。姚美村等复制乙醇致小鼠肝损伤模型，同时用不同工艺提纯的葛花提取物连续多日灌胃，以评价小鼠体质量变化、肝脏指数、血清ALT、AST和MDA等指标，来体现葛花提取物的不同纯度及其不同有效物质对小鼠肝损伤保护作用的差异，结果显示葛花中的两种主要黄酮类物质鸢尾苷、6-O-木糖鸢尾苷等可能是其防治ALD的物质基础，但具体作用途径机制仍需进一步深入研究。
　　2. 葛根 葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi或甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的干燥根，《千金方》中记载葛根主解酒毒。其主要成分有：①异黄酮类，主要包括葛根素、大豆苷元（大豆素、大豆黄素）、大豆苷等；②葛根苷类，主要包括葛根苷A、B、C 3种；③三萜皂苷类；④生物碱及其他化合物。在葛根的有效成分中，最主要活性成分是异黄酮类。早期研究发现葛根可通过清除自由基和抗脂质过氧化途径而降低血黏度，促进血液循环，使乙醇加速排泄，减少对肝脏及其他各系统的损害，起到保肝健脑等作用。吴国琳等采用乙醇、玉米油、吡唑混合液灌胃的方式制备大鼠ALD模型，8周后抽取股静脉血并取组织切片，通过光镜下观察肝脏组织病理变化，检测血液中肝组织转化生长因子-1（transforminggrowth factor-1，TGF-1）和-平滑肌肌动蛋白（-smoothmuscleaction，-SMA）的表达，发现葛根素对ALD有保护作用，能明显改善ALD大鼠的血清转氨酶和肝纤维化指标，可调节肝组织TGF-1和-SMA的表达。崔团等采用Lieber-Decarli酒精饮料饲养的大鼠ALD模型，8周后采血取肝组织，来观察葛根的乙醇提取物葛根总黄酮对Lieber-Decarli ALD大鼠库普弗细胞活化信号通路的干预作用，结果发现，葛根对慢性ALD有保护作用，其药理作用同其抑制ALD中内毒素活化肝脏库普弗细胞分泌炎症因子的病理途径有关。冯琴等按Lieber-Decarli配方制备酒精液体饲料，以定量喂饲大鼠的方法，复制大鼠ALD模型，8周末取材观察，葛根组脂肪变性积分显著低于模型组，葛根组的甘油三酯（triglyceride，TG）沉积受到一定程度的抑制，较模型组有显著性差异（P0.05），肝组织-谷氨酰转移酶（-glutamyltransferase，-GT）活性显著低于模型组（P0.05），肝组织MDA含量、一氧化氮合酶（No synthetase，NOS）活性显著低于模型组，SOD活性显著高于模型组并接近正常水平，通过上述指标说明，葛根对ALD有显著的抑制作用。卢雯雯等采用乙醇、玉米油、毗哇混合液灌胃的方法制造酒精模型，8周后抽取股静脉血并处死，来观察葛根素对ALD大鼠血清转氨酶和肝纤维化指标的影响，结果发现，葛根素具有一定的降低ALD大鼠血清转氨酶和肝纤维化指标的作用，对ALD有保护作用，至于其机制有待进一步研究。
　　3. 枳椇子 枳椇子为鼠李科植物枳椇Hovenia dulcisThunb.的干燥成熟种子，亦为临床常用的解酒药物。孙思邈的《千金翼方》载枳椇以为木屋，屋中酒则味薄。有研究表明，枳椇子有显著的解酒、保肝、抗肝纤维化等作用。王文香等采用大鼠肝纤维化造模，用酒精灌胃的方法复制ALD模型，观察枳椇子对ALD的防治作用，12周后，以放免法测定透明质酸（hyaluronic acid，HA）、层黏蛋白（laminin，LN）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）及Ⅳ型胶原（ＣⅣ）水平，HE染色观察肝细胞结构变化、纤维化程度。结果表明，与模型组比较，早期干预组和枳椇子组HA、LN、PCⅢ氨基末端肽、CⅣ的含量均有不同程度的降低，枳椇子组降低更明显，更接近空白对照组；病理学观察枳椇子组肝脏小叶结构完整，肝板排列整齐，肝细胞见有脂肪变性，未见明显肝细胞坏死，中央静脉周围有少量纤维组织增生。以上指标提示枳椇子早期干预和后期治疗在保护肝细胞、减缓肝纤维化发展方面有作用。陈春晓等研究发现，枳棋子对酒精诱导大鼠的实验性肝损伤具有保护作用，可以减轻酒精引起的大鼠肝脏脂肪变性及炎性细胞浸润，减少纤维增生。张永昕等建立大鼠慢性酒精性肝病模型，随机分为正常对照组、水飞蓟素组、模型组及枳椇子总黄酮高、中、低剂量组，每组10只，经10周灌胃后取材，枳椇子总黄酮各剂量组可显著降低大鼠血清中ALT、AST含量和肝组织MDA含量（P0.01），提示枳椇子总黄酮对酒精引起的肝损伤有良好的防治作用；枳椇子总黄酮各剂量组可显著降低大鼠血清中肿瘤坏死因子-（tumormecrosis factor-，TNF-）、HA、LN含量，升高白介素-10（interleukin-10，IL-10）水平（P0.01），提示枳椇子总黄酮能减轻酒精引起的炎性反应，并可对抗肝纤维化的形成，对酒精引致的肝损伤有良好的防治作用。丁静用高脂饮食和酒精灌胃法诱发大鼠AFL模型，并用单味中药枳椇子进行早期及中期干预，90d后处死，取血及肝组织，检测肝功能、血清SOD及肝纤维化四项（HA、LN、PⅢP、CⅣ），并对大鼠肝脏行病理学检查，结果显示，灌胃90d后大鼠形成AFL甚至肝炎模型，早期干预组的血清AST、ALT显著降低，在组织学上可明显改善肝细胞的脂肪变性及炎性坏死。其机制可能是通过抗炎、抗氧化及逆转早期肝纤维化而发挥作用，肝脏脂肪变及炎症显著改善。
　　4. 黄芪 阮明凤等采用乙醇浓度、剂量逐渐递增法复制酒精性肝病模型。选取健康Wistar雄性大鼠36只，随机分成正常对照组、模型组、黄芪治疗组3组。12周后观察各组肝组织细胞间黏附因子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）的表达及肝组织形态学改变。结果发现模型组ICAM-1的表达明显增强，与对照组有显著性差异；黄芪治疗组与酒精组相比ICAM-1表达明显减弱，肝组织损害减轻。表明黄芪对酒精性肝病有防治作用，其机制可能与抑制肝细胞中ICAM-1的表达有关。王登妮等研究认为，黄芪抗肝纤维化的机制主要有：①减轻肝脏的损伤性改变，降低肝组织羟脯氨酸及肝纤维化指数（FI）；②降低血浆内毒素含量、ALT及肝组织MDA水平；③减缓肠源性内毒素血症可能为防治肝纤维化的作用机制之一。
　　5. 丹参 丹参是一味临床常用的中药，有活血化瘀之功。新近研究表明，丹参对ALD有一定改善作用。熊宗斌等报道，采用HE染色观察肝组织形态学改变，逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）检测肝组织toll样受体4（toll like receptor 4，TLR4）mRNA及血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）mRNA的水平，以免疫组织化学方法检测TLR4蛋白表达水平，结果显示，丹参能减轻酒精所引起的慢性肝损伤模型小鼠肝细胞脂肪变性坏死，下调TLR4 mRNA表达及HO-1 mRNA表达，并能使TLR4阳性细胞数明显减少，说明丹参可通过对TLR4信号传导途径的影响来减少酒精所引起的肝损伤。白顺滟等将36只SD大鼠随机分为3组（空白组，模型组，丹参治疗组），每组12只，分别于实验12周后处死。通过检测肠道细菌易位率、肠黏膜通透性，观察肝脏生化、肝脏和末段回肠黏膜病理学改变，发现大鼠对ALD及肠道屏障功能具有双重保护作用。
　　6. 黄芩 李海燕等用56度白酒每次按5mL/kg灌胃，2次/d，连续4周，第5周开始按5mL/kg灌胃，1次/d，同时开始灌胃给予不同剂量黄芩苷，1次/d，连续4周。末次给药后，禁食12h后取材，测定ALT、AST、MDA、TNF-含量，测定SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性，并且取肝脏右叶做病理检查，结果显示，对酒精肝大鼠血清及肝脏生化指标的影响模型组大鼠血清和肝脏中ALT、AST、MDA含量显著增加，SOD和GSH-Px活性明显降低，给予黄芩苷的酒精肝大鼠血清ALT、AST、MDA和TNF-含量明显降低，SOD和GSH-Px活性明显增加；并且黄芩苷高剂量组大鼠大部分肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，部分肝细胞呈轻度浊肿，肝损伤明显轻于模型组，说明黄芩苷对ALD大鼠具有保护作用，其作用机制可能与降低TNF-和MDA含量有关。
　　7. 灵芝 李敏等通过小鼠皮下注射CCl4油溶液造模。以高、中、低剂量灵芝三萜进行灌胃，剂量分别为180、90、45mg/kg。收集血清检测ALT、AST、谷氨酰转移酶（GGT）。结果显示与模型组相比，灵芝三萜治疗组能够显著降低小鼠血清中AST、ALT、GGT。病理切片清楚地显示灵芝三萜能够显著减轻小鼠肝损伤的程度。
　　可以用于治疗ALD的单味中药提取物有很多，除以上论述的之外，许多学者对于铁皮石斛、枸杞子、三七、决明子、肉苁蓉等用于ALD也进行过相关的实验研究。
　　临床组方的应用研究
　　1. 经典成方加减
　　1.1 茵陈五苓散 周焕等通过连续9周以50%白酒灌胃方法，建立Wistar大鼠ALD模型。于第5周和第9周末，所有大鼠均禁食12h，尾静脉取血，离心10min，取血清，按试剂盒所规定的方法检测各项指标。于第2次取血后脱颈椎处死，剖取肝脏，在距肝脏边缘0.5cm处取材，10%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋切片，HE染色，光镜观察其病理变化。结果显示经过给药治疗，治疗组大鼠血清ALT、AST下降至与正常组接近，且病理学观察肝脏损害明显减轻，说明茵陈五苓散能有效治疗ALD。预防1组和预防2组与模型组比较，血清ALT、AST均明显降低（P0.01），病理学观察亦较模型组显著减轻。提示茵陈五苓散对ALD有良好的预防作用。实验结果表明，茵陈五苓散具有显著的护肝作用，能有效地预防和治疗大鼠ALD，为临床防治酒精肝提供了相关的实验依据，但其机制有待于进一步研究探讨。
　　1.2 加味四逆散 郭晓萍等将大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、加味四逆散（柴胡、白芍、枳实、白术、茯苓、丹参、姜黄、郁金、甘草）组、小柴胡颗粒组，每组12只。正常喂养1周后，除正常对照组外，其余各组均给予40%乙醇6gkg-1d-1，分2次灌胃以后每2周灌胃乙醇量与浓度逐渐递增，第10周时乙醇浓度为60%，灌胃量达到10gkg-1d-1，连续灌胃12周成模。正常对照组给予相同体积的0.9%氯化钠溶液。末次给药24h，空腹12h，取血测血脂，同时肝脏左右两叶各取两块组织标本。结果显示加味四逆散可明显减轻酒精引起的肝细胞损伤，表现为能使肝脏脂肪变性程度明显改善，能有效降低总胆固醇（total protein，TC）、TG、低密度脂蛋白胆固醇（low-densitylipoprotein cholesterol，LDL-C）水平，使高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）含量明显升高。其作用机制可能是通过减轻酒精代谢产物乙醛对肝脏的直接毒性作用，增强脂肪酸的肝细胞正常代谢，减少脂质在肝中的沉积，从而发挥调节脂质代谢、抗ALD的作用。
　　2. 临床验方
　　2.1 清肝利湿解酒汤 梁卫等将雄性SD大鼠随机分对照组、造模组，采用白酒灌胃、高脂饲料加硫酸亚铁喂食法制备AFL大鼠模型。给药6周后测定各组大鼠体质量、肝指数，采用酶标仪检测血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、AST、ALT、GGT、血清和肝组织中MDA含量及SOD活性。结果显示清肝利湿解酒汤具有改善肝功能、降低血脂、减轻脂质过氧化反应、增强抗氧化能力的作用。
　　2.2 清肝活血方 韩向晖等利用酒精-玉米油-吡唑复合试剂制备大鼠慢性ALD模型。将造模大鼠随机分为模型组、清肝活血方组、清肝方组及活血方组，另设CCl4对照组和正常对照组，每组10只。造模各组大鼠每天上午以酒精复合试剂灌胃，下午各中药组分别给予清肝活血方9.5gkg-1d-1、清肝方3.0gkg-1d-1、活血方6.5gkg-1d-1灌胃，模型组给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃；CCl4组每周1次腹腔注射CCl40.3mL/kg，正常对照组给予0.9%氯化钠溶液灌胃，连续治疗2周。组织病理学观察肝脏病理变化；ELISA法检测血清总同型半胱氨酸（tHCY）水平；流式细胞术检测肝细胞凋亡率；RT-PCR和Western blot法检测大鼠肝脏ERS凋亡相关因子真核生物翻译起始因子（eIF-2A）、磷酸化eIF-2A（p-eIF-2A）、葡萄糖调节蛋白78（GPR78）、Caspase-3基因和蛋白表达。与正常对照组比较，模型大鼠出现了典型的慢性ALD病理改变，如脂肪变性、炎症甚至纤维化；肝细胞凋亡明显增加，凋亡率达到了正常大鼠的5倍以上，且以早期凋亡为主；血清tHCY水平显著升高；p-eIF-2A、GRP78及Caspase-3蛋白表达明显增高（P0.01）；GRP78及Caspase-3 mRNA表达量显著增高（P0.01，P0.05）。与模型组比较，清肝活血方及拆方组大鼠肝损伤及肝细胞凋亡程度明显减轻，血清tHCY水平显著降低，p-eIF-2A、GRP78及Caspase-3蛋白表达明显降低（P0.01）；清肝活血方组GRP78和Caspase-3mRNA表达明显降低（P0.01，P0.05）；清肝方组仅GRP78mRNA表达明显降低（P0.05）。以上数据表明清肝活血方及其拆方可能通过降低血清tHCY水平及肝脏ERS凋亡相关因子的表达抑制ALD动物肝细胞ERS性凋亡。
　　2.3 解酒护肝饮 杨牧祥等选取健康SD大鼠，随机分为正常组、模型组、解酒护肝饮低剂量组、解酒护肝饮高剂量组、葛花解酲汤组、益肝灵组，经4周造模成功后，给药2周，取材检验肝功指标及病理探查，实验结果显示：解酒护肝饮高剂量、益肝灵在对血清ALT的降低作用上优于解酒护肝饮低剂量，与葛花解酲汤相当；解酒护肝饮高剂量、葛花解酲汤、益肝灵在对肝组织ALT的降低作用上均优于解酒护肝饮低剂量，但三者的疗效相当；对血清及肝组织AST的降低作用，各治疗药物疗效相当。以上实验说明解酒护肝饮既能保护肝细胞，抑制肝组织内ALT、AST的升高，又能稳定肝细胞膜，抑制ALT释放入血，从而有效防治ALD，且高、低剂量具有量效关系。
　　除了上述的成方及验方外，还有许多方剂用于临床和科研，均取得了较好的疗效，比如茵陈蒿汤、橄榄解酒饮、解酒宁煎剂等。
　　小结
　　综上所述，近年来中医药在防治酒ALD方面取得了很多科研成果，其临床意义是值得肯定的。ALD为多脏器多系统损伤，如能运用现代分子生物学手段，对整体脏器进行深层次、系统化的作用机制探讨与研究，可将中药对其整体调节的优势能更好地发挥出来。并且可以利用现代先进的科学技术及精密仪器，来提取出纯度更高的单味中药有效提取物，进行上述单味中药的横向比较，试验出哪种物质效果更佳而副作用最少，使之能更好地应用于临床。
　　临床方药的研究通过上述实验可以看出，以上经典方剂和经验组方都有保护肝细胞膜、抗脂质过氧化和自由基损伤、促进肝脏血液循环、提高免疫调节及降低ALT和AST等指标的作用，但是存在实验研究结果与临床疗效尚不完全一致的情况；国内外多数是对单个复方进行研究，将多个复方同时进行筛选比较研究尚属空白，又因中药复方抗肝损伤机制比较复杂、科学发展因素等客观条件的影响，对其有效成分及细胞分子水平，有待进一步研究。此外，肝损伤动物模型还需进一步完善，结合中医辨证分型的研究思路，造模技术还须拓宽。探索新的造模方法，将会推动整个研究的发展，也会带动临床疗效的提高。