麝香壮骨膏控制菌检查的方法学验证

　　橡胶膏剂是指药物或药材提取物与橡胶为主的基质混合后，涂布于裱背材料上的外用剂型。麝香壮骨膏为片状橡胶膏剂，具有镇痛、消炎之功效，用于风湿痛、关节痛、腰痛、神经痛、肌肉酸痛、扭伤、挫伤。《中国药典》（2010年版）一部对橡胶膏剂新增微生物限度检查项目，每10cm2不得检出控制菌（金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌）。按照《中国药典》（2010年版）一部附录II及附录XIII的要求，对麝香壮骨膏进行了微生物限度检查方法及方法学验证的试验研究，建立了麝香壮骨膏控制菌的检查方法。
　　1仪器与材料
　　1。1仪器仪器采用SHZ82A型水浴恒温振荡器（金坛市城西天竟实验仪器厂）；YXQLS50型立式自动电热压力蒸汽消毒器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；DHP600电热恒温培养箱（北京永光明医疗设备厂）；DHG9075A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）。
　　1。2样品样品为麝香壮骨膏（东阿阿胶医疗器械有限公司药业分公司国药准字：批号：12020112、12020805、12020705），主要成份：人工麝香、生川乌、生草乌、薄荷脑、水杨酸甲酯、冰片、山奈、白芷、樟脑、硫酸软骨素、盐酸苯海拉明、麻黄、八角茴香、苍术、当归、干姜。
　　1。3菌种与培养基大肠埃希菌〔CMCC（B）44102〕、金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕、铜绿假单胞菌〔CMCC（B）64941〕、枯草芽孢杆菌〔（CMCC（B）63501〕、白色念珠菌〔（CMCC（F）98001〕、黑曲霉〔（CMCC（F）98003〕，以上菌种均购自中国药品生物制品检定所，传代次数不超过五代。培养基为营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、营养琼脂培养基（批号分别为1203132、1003182、100129、1110082、1103162）均为北京三药科技开发公司生产。0。9氯化钠注射液，pH7。0氯化钠蛋白胨缓冲液和聚山梨酯80均按《中国药典》（2010年版）一部附录配制。
　　2方法与结果
　　2。1验证用菌液的制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的新鲜培养物于营养肉汤培养基中，恒温培养箱3035培养1824h。将上述三种培养物用0。9氯化钠注射液稀释为每1ml含菌数为10100cfu的菌悬液作为验证用菌液。
　　2。2供试液制备
　　2。2。1稀释剂制备配制各种稀释液，pH7。0氯化钠蛋白胨缓冲液200ml，分别加入5g、10g、20g、30g和40g聚山梨酯80，混匀；对麝香壮骨膏进行供试液制备试验，采用振荡法观察分散情况，确定合适的稀释剂。结果聚山梨酯80为30g和40g供试液较黏稠且有明显的油水分层，影响供试液的吸取，不便于检验操作；聚山梨酯80为5g和10g的供试液均较澄清，溶解不充分。所以最终选用pH7。0氯化钠蛋白胨缓冲液200ml加入20g聚山梨酯80作为稀释剂。
　　2。2。2供试液制备取供试品4贴，去掉保护层，放置在无菌玻璃器具上，粘贴面向上。用无菌纱布覆盖粘贴面，共剪取大小约100cm2的块状，然后将其置于100ml稀释剂中，置40水浴恒温振荡器中，频率为200转分，振荡30min，制成1：10的供试液。
　　2。2。3阴性对照稀释剂作为阴性对照液
　　2。3试验方法
　　2。3。1金黄色葡萄球菌试验组：分别取供试液10ml和1ml的金黄色葡萄球菌验证菌液，加入100ml营养肉汤培养基中；供试品组：取1供试液10ml加入100ml营养肉汤培养基中；阴性菌对照组：分别取供试液10ml和1ml的大肠埃希菌验证菌液，加入100ml营养肉汤培养基中；阴性对照组：阴性对照液10ml加入100ml营养肉汤培养基中。上述各组置3035恒温培养箱内培养2448h，分离划线于甘露醇氯化钠琼脂平板上，依照金黄色葡萄球菌的检查方法进行检查。
　　2。3。2铜绿假单胞菌试验组：分别取供试液10ml和1ml的铜绿假单胞菌验证菌液，加入100ml胆盐乳糖培养基；供试品组：取供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基；阴性菌对照组：分别取供试液10ml和1ml的大肠埃希菌验证菌液，加入100ml胆盐乳糖培养基；阴性对照组：阴性对照液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基。上述各组置3035恒温培养箱内培养2448h，分离划线于溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上，依照铜绿假单胞菌的检查方法进行查。
　　3分析与讨论
　　橡胶膏剂中除了主要药用成份外，基质主要为橡胶、凡士林、液状石蜡和羊毛脂等高分子材料，因此选用合适的溶剂来制备供试液，是橡胶膏剂微生物限度检查中制备供试品溶液很关键的步骤。因橡胶、松香、松香衍生物、凡士林、羊毛脂等橡胶膏剂基质试验中不易找到可使背衬层与药物贴库层、粘胶层分离的适宜溶剂，故选用pH值为7。0氯化钠蛋白胨缓冲液200ml加入20g聚山梨酯80作为稀释剂，通过振荡可使大部分药物贴库层中可能存在的菌体沉降入水相中。
　　配制稀释剂时比较振荡法与均质器拍击法，采用均质器拍击法时，若时间小于3min，分散结果不太理想；但延长拍击时间就会不同程度的出现胶黏团，影响供试液吸取。另外均质器拍击法无菌操作的安全性与简便性不如振荡法。综合考虑，试验选用振荡法。
　　麝香壮骨膏成分中均含有冰片，具有抑菌作用。但因控制菌检查时，供试品溶液的浓度为1：10，且只取10ml加入至100ml的相应培养基中，冰片的浓度比较低，所以控制菌的生长未受到影响。
　　按照中国药典2010年版的要求，通过对麝香壮骨膏进行微生物限度检查方法学验证试验，结果表明，对本品金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的检查，均可采用常规法进行检验。