参环毛蚓体内核苷磷酸化酶的活性测定及动力学分析

　　参环毛蚓Pheretima aspergillum(E. Perrier)属钜蚓科动物，药材习称广地龙，是《中华人民共和国药典》收载的 4 种来源动物中品质最优者。在广地龙入药的四千多年历史中，其平喘作用为临床常用。由于次黄嘌呤及黄嘌呤是目前已知地龙平喘作用的重要物质基础，因此，次黄嘌呤的存在与否及含量高低自然成为评价广地龙平喘药效的重要指标性成分。迄今为止，参环毛蚓体内次黄嘌呤的合成代谢途径研究尚属空白，无法了解次黄嘌呤如何生成及影响和控制其产量与代谢方式的因素。众所周知，酶是细胞内生物化学反应的催化剂，其存在与否及活性的高低直接影响产物的形成和产量。据此，本研究借鉴国外相关研究成果，以次黄嘌呤代谢过程中产生重要作用的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)为主要研究对象，构建能快速准确检测参环毛蚓体内 PNP 酶活性的方法，考察该酶活性效应及其作用规律，为进一步确认及探究参环毛蚓体内嘌呤合成代谢途径，解析其调控机制奠定实验基础。
　　1材料与方法
　　1.1仪器及试剂 P680A LPG 高效液相色谱系统、ASI-100 自动进样器、UVD170U 紫外检测器，美国戴安公司;TL-18M 台式高速冷冻离心机，上海市离心机械研究所有限公司;TG16-W 微量高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;SG8200HE 超声波清洗机，郑州南北仪器设备有限公司;BP211D 十万分之一精密电子天平，德国赛多利斯公司。
　　1.2实验动物 样本采自广东省广州市番禺区，经广州中医药大学李薇教授鉴定为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima asperfillum(E.Perrier)。选择体型健硕、活力较强、性成熟、体表具有明显生殖环带、平均湿质量约 14.1 g 的健康成蚓，经无菌超纯水清洗后，放入铺有湿润灭菌滤纸的塑料箱中，在室温(222) 下，避光培养 48 h 以备用。
　　1.3标准溶液配制与样品处理
　　1.3.1标准溶液配制 精密称取肌苷标品 3.88 mg，次黄嘌呤标品 2.51 mg，分别置于 2 mL 量杯中，用 PBS缓冲液溶解并定容至 10 mL 的容量瓶，均稀释为 500滋molL-1作为母液，置于 4  冰箱中备用。
　　1.3.2参环毛蚓粗蛋白的制备 解剖活体参环毛蚓，去除肠道后剪取体壁组织用 PBS 缓冲液浸泡润洗 3次，转移至培养皿剪碎后用匀浆器研磨，以 0.1 molL-1pH7.4 的 PBS 缓冲液为溶剂，将组织液转移至离心管，4  12000 rmin-1离心 30 min，将提取液分装，-20  保存备用。以小牛血清蛋白(BSA)为标准品，采用 Bradford 法测定粗蛋白含量。
　　1.4色谱条件 采用 Ecosil C18-AQ 柱 (250 mm4.6mm，5滋m)，流速为 0.8 mLmin-1，柱温为室温，检测波长为 254 nm。流动相 A 为 10 mmolL-1磷酸二氢铵缓冲液，用磷酸调 pH 至 4.5，B 为 10 %甲醇。采用梯度洗脱：0 10 min A-B(50 50)，10 15 minA-B (20 80)，15 25 min A-B (0 100)，25 35min A-B(0 100)。
　　2结果
　　2.1方法学考察结果
　　2.1.1方法专属性 在优化的色谱条件下，肌苷峰型良好，与代谢产物分离良好。
　　2.1.2标准曲线的绘制与检测限 取次黄嘌呤标准液，用 PBS 缓冲液稀释成 0.5，2，4，5，10，15，20，40滋molL-1的系列标准液，取 10滋L 按色谱条件进行 HPLC 分析，测定次黄嘌呤含量(n=5)。以次黄嘌呤峰面积Y为纵坐标，次黄嘌呤浓度(X，滋molL-1)为横坐标，绘制标准曲线。结果表明次黄嘌呤在0.5~40滋molL-1浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y=0.0653X-0.0394，r=0.9996。次黄嘌呤检测限为 0.05滋molL-1(S/N3)。
　　2.2肌苷在参环毛蚓组织粗蛋白中的酶反应动力学
　　2.2.1蛋白浓度考察 为了考察参环毛蚓体壁组织酶反应体系中合适的蛋白浓度，以不同蛋白浓度(X)与产物次黄嘌呤的浓度增加量绘制曲线。结果表明样品的蛋白浓度在 0 7.5 mgmL-1范围内，与产物浓度变化量呈线性关系，因此在该浓度范围内的广地龙粗蛋白提取物可用于酶活性分析。
　　2.2.2孵育时间考察 为了考察适当的的孵育时间，以产物浓度与孵育时间绘制曲线，结果见图 3。在0 30 min 的反应时间内，酶促反应呈线性上升，而30 min 后，酶活力基本稳定，说明酶促反应已完成，处于稳定状态，故选用孵育时间 30 min 作为酶活力测定的时间。
　　3讨论
　　在酶活性的检测方法中，高效液相色谱法因其灵敏度高、选择性好而应用广泛，尤其是对目标成分的检测能做到快速、准确、实时的特点，更受国内外学者的欢迎。本研究参考了文献有关 HPLC 方法，并以此为基础对流动相的比例、梯度洗脱条件进行了改进及优化，实现了底物与产物之间的良好分离。
　　对酶活性的测定是通过检测单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来实现的，即测定酶反应的速度。而酶反应速率受蛋白浓度和反应时间影响，只有当反应速率与蛋白浓度及孵育时间均显线性关系时，才是酶活性的真实表现。因此，本研究考察了酶反应体系所需的最佳蛋白浓度和孵育时间。首次建立了参环毛蚓体内次黄嘌呤代谢酶活性测定相关的实验体系，为进一步研究平喘有效物质的代谢途径及其调控机制提供了良好的实验平台。
　　鉴于国外有研究学者已从寄生虫和哺乳类动物体内发现 PNP 是主导次黄嘌呤生成的关键酶。因此，本研究选取了 PNP 作为研究对象。此外，与嘌呤合成代谢途径相关的酶还有腺苷脱氧酶(ADA)和黄嘌呤氧化酶(XO)。本实验除了 PNP 外，还利用上述实验体系对 ADA 和 XO 也进行了酶活性分析，获得相应的动力学参数。此研究结果与国外已报道的人红细胞、寄生虫等嘌呤合成代谢途径关键酶活性的结果颇为一致。由此，提示参环毛蚓体内有可能也存在类似嘌呤合成代谢途径。