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Adv。Mater。细胞外基质加强互锁支架抗剪切抗压缩促成骨

  几十年来,工程师和科学家向大自然寻求设计灵感,导致了生物仿生学和仿生工程的诞生。为了促进具有机械互锁界面的模块化组织工程, 互锁支架应具有生物相容性,保持高孔隙率以促进细胞和营养物质的迁移,并应保护细胞免受所模拟的解剖结构的机械应力 ,与ECM和细胞协同工作的联锁支架可以改善模块化组织工程的结果。在此, 内布拉斯加大学林肯分校的Jingwei Xie教授组 报告了一种 新型的的互锁和细胞外基质强化生物材料 ,它能 承受生物条件下的剪切和压缩负荷,并能提高细胞生存率(图1) 。相关文章  "Extracellular Matrix Secretion Mechanically Reinforces Interlocking Interfaces"于2022年11月29日发表在杂志《ADVANCED MATERIALS》上。
  图1材料的制备和表征
  尼龙-6,6被选为模型聚合物,因为它的性质与聚乳酸相似,易于生产,而且由于本研究需要大量纤维,因此成本较低。该团队试图优化纤维的长径比以获得最佳的抗压和抗剪切性能,直径为10:1,以获得 最佳的绒毛排列 。在确定了每种支架类型的结构特征后,以固定速率进行了抗压和抗剪切实验。剪切阻力是使用改进的拉伸实验测量的(图2a),纤维可以在横向负载的情况下互锁并抵抗剪切力,测试了横向负载的三种情况:无负载、小负载(~5N)和大负载(~20N)(图2b),发现 较高的横向载荷可以促进更深程度的纤维渗透,并提高支架的抗剪切强度 。支架对横向负荷的程度有不同的反应,如长而厚的纤维在无负荷下有较高的临界力,而短而薄的纤维在较高的横向负荷下有较高的临界力(图2 c-e)。压缩实验包括以恒定的速率平行于互锁的支架施加压缩载荷,持续4个周期(图2 f),抗压能力随着纤维直径的减少而减少,图2g中给出了最大抗压负荷的统计结果图。加权T-Score显示O型支架(1.5dTex,30μm纤维长度)是最理想的,因此,聚乳酸(PLA)因其机械强度、生物相容性和易植入性而被选为理想的聚合物。最后,为了确保细胞活性,将MC3T3-E1细胞接种在聚乳酸支架上,在第1、3、5和7天测量细胞活力, 显示细胞增殖显著增加 , 第7天胶原染色显示细胞附近有少量胶原沉积 。
  图2. 支架的抗剪、抗压性能
  细胞存活率评估
  在机械压缩细胞的过程中会诱发多种细胞死亡,因此,应力屏蔽是一种理想的支架特性,作者提出了一种纤维弯曲机制,它可能对粘附在纤维上的细胞产生小的局部变形,但能减轻大的全细胞压缩(图3 a)。首先使用细胞活力测定法评估细胞毒性。结果发现,用3D打印的压缩嵌件直接培养MC3T3-E1细胞后,存活率没有明显增加,但在24和48小时后仍保持90%以上的存活率(图3 b)。用吸光度表示静态培养条件下的细胞的正常化,我们注意到在1.1千帕的压缩负荷下,存活率首次明显下降,在2.8和5.5千帕下,存活率急剧上升(图3 c)。24小时后,发现 互锁支架比电纺纳米纤维膜有更明显的保护作用 (图3 d)。综上所述, 互锁支架显示了在机械压缩过程中保护细胞的能力,这主要是由于支架有能力抵御纤维弯曲带来的压缩 。
  体外ECM的沉积促进细胞成骨分化
  作者假设,随着播种细胞及其分泌的ECM的增殖,支架也会经历机械强度的增加。为了研究这一点,首先必须确定ECM成分的沉积。将MC3T3-E1细胞的长期培养40天。COL1A和DAPI的共聚焦成像显示,I型胶原蛋白的分泌在第10天时不多,在第20、30和40天之间明显增加(图4 a)。在第0天、第10天、第20天、第30天和第40天对各种成骨基因进行了分析,以证实在用互锁支架培养期间可以发生成骨分化。为此,用PCR分析了BMP7、RANKL、BSP、ALP、OCN、OPG、RUNX2和Col1A(图4 b),发现除OPG外,每个被检测的基因都 随着培养时间的推移而明显增加 。 成骨标志物的变化进一步表明,三维环境能够刺激成骨分化 。
  图4. 胶原蛋白增强的互锁支架的细胞活力及成骨分化
  互锁支架与外源或内源细胞和ECM协同发挥作用
  最后,为了说明互锁支架如何与外源或内源细胞和ECM协同发挥作用,在培养10、20、30和40天后,测量了MC3T3-E1细胞播种的互锁支架的压缩和剪切阻力曲线(图5 a和b)。通过测量羟脯氨酸,在第10、20、30和40天对胶原蛋白(COL1A)进行了量化,发现从第10天的支架大约为60克,到第40天支架增加到的大约250克(图5 c)。并通过线性回归证实,从基线到第40天,压缩阻力大约增加了4倍,并与胶原蛋白含量的增加高度相关(图5 a,c和d)。同样通过线性回归证实,剪切阻力从基线到第40天大约增加了10倍,并与胶原蛋白含量的增加密切相关(图5 b & e)。图5 f和g中指出了与基线的百分比变化。
  图5. MC3T3-E1细胞种植的互锁支架在培养10、20、30和40天后的应力曲线
  综上所述,一种新型的 互锁支架的生物力学基础是有必要的 ,该支架 在机械压缩过程中保护细胞,并通过与细胞及其ECM分泌的协同机制进行机械强化 。表明,在长期培养过程中, 互锁的界面能够维持MC3T3-E1细胞的生长,它们分泌的ECM能够机械地加固界面,并促进成骨分化 。这种互锁支架有可能用于模块化组织工程界面(如肌肉-骨、肌腱-骨、骨-软骨、真皮-表皮交界处)和结构性生物粘附。
  文献来源:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202207335
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