深究RDP多肽修饰的姜黄素隐形脂质的作用论文

　　治疗脑内疾病的必要途径需将药物靶向性输送入脑内。以脑靶向性的蛋白或多肽作为载体，可能会实现药物的脑靶向转运。我们实验室以往的研究表明，狂犬病毒糖蛋白（rabiesvirusglycoprotein，RVG）的衍生肽RDP（RVGderivedpeptide），可携带核酸、蛋白等生物大分子入脑。脂质体是一种安全有效的药物递送方式。脂溶性化合物可被包裹在脂质体内核中，在体内安全释出以发挥作用。此外，脂质体较易修饰，从而可使其具有靶向性和高效性。本研究将在脂质体表面的PEG链端连接RDP多肽，以具有抗肿瘤效果的天然植物提取物姜黄素为模型药物，研究该RDP修饰脂质体的脑靶向作用，从而可能为向脑内送脂溶性化合物以治疗脑部疾病，提供一种崭新的途径和方法。
　　1材料与方法
　　1。1试剂
　　姜黄素，纯度gt；98，购自美国Sigma公司；大豆卵磷脂、胆固醇，纯度gt；95，均购自上海Aladdin公司；DSPEPEGNHS（PEGMW2000），购自美国Nanocs公司；CysRDP，纯度gt；95，购自上海吉尔公司；乙酸乙酯、乙腈、冰醋酸均为色谱纯。
　　1。2仪器
　　高效液相色谱仪（包含SPDM20A检测器和LC20AD泵），购自日本岛津公司；激光粒度及zeta电位分析仪（NanoZS），购自英国马尔文公司；生物质谱仪autoflexspeedMALDITOFTOF，购自德国BrukerDaltonic公司；AB135S电子分析天平，购自瑞士梅特勒托利多公司；BF2000氮气吹干仪，购自上海八方世纪科技有限公司；XHFD高速分散器，购自宁波新芝生物科技有限公司。
　　1。3细胞株及培养体系
　　人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87MG（实验室冻存），采用含10胎牛血清的DMEMH培养基培养，置于37、5CO2、饱和湿度下的培养箱内。隔天换液，待细胞密度长至8090时，按照13的比例传代。传代时，加入消化液一定时间后去除，用培养基吹打成单个细胞悬液，取生长良好、活性大于98的细胞进行后续实验。
　　1。4实验动物
　　昆明小鼠80只，各半，体质量（202）g，购自于重庆滕鑫生物技术有限公司。小鼠饲养于西南大学药学院SPF小鼠饲养室，恒温、恒湿，自由进食、进水。
　　1。5脂质体的制备和表征
　　1。5。1导向化合物的合成
　　按照摩尔比21的比例精密称取DSPEPEGNHS和RDP溶于DMF中，然后加入20L的N甲基吗啉，置于4mL离心管中，在搅拌器中避光搅拌48h。取出反应液，置于透析袋（MW3500）中，放入2L去离子水中透析48h后（每6h换水1次），冷冻干燥，20保存。
　　1。5。2脂质体的制备
　　采用薄膜分散法分别制备姜黄素脂质体（CURL）和RDP修饰的姜黄素隐形脂质体（RDPCURL）。按照处方量（Tab1）精密称取各种脂材于10mL茄形瓶中，加入氯仿3mL溶解，37减压旋转蒸发10min，使其成均匀的薄膜。然后加入1mL去离子水，37于水浴摇床中水化1h，形成悬浮液，间歇超声90s，得到澄清透明呈淡黄色乳光的脂质体溶液，并分别过100nm的膜使粒径分布均匀，4冰箱内保存。
　　1。5。3DSPEPEGRDP比例筛选
　　按上述脂质体制备方法制备一系列含不同比例DSPEPEGRDP的含药靶向脂质体（DSPEPEGRDP分别为总摩尔量的。0。5、1。0、2。0和5。0）。采用MTT法考察不同密度下的RDPCURL对U87MG细胞抑制率的影响。取对数生长期状态良好的细胞，用0。25胰酶消化液消化后，调整细胞浓度为5107L1，以每孔500L（5000个孔）接种于96孔板，培养24h贴壁后加入不同浓度的CURL和RDPCURL，浓度依次为150、75、37。5、18。8、9。4、4。7molL1，孵育48h后，弃去培养基，每孔加入浓度为5gL1的MTT（20L），37培养4h，弃去培养液，每孔加入100L二甲基亚砜（DMSO）溶解蓝紫色甲颗粒，用酶标仪在波长为490nm下测定光吸收值（OD）。每组实验重复3次，每个样品做3个平行样。全部实验均设DMSO对照组。
　　1。5。4脂质体粒径、电位、分散度测定
　　用激光粒度及zeta电位分析仪分别测定CURL和RDPCURL的粒径、Zeta电位、分散度（PDI）。1。5。5脂质体包封率测定采用透析破乳法，取用均质机处理过的CURL和RDPCURL，每组实验分成两份（每份400L）：一份用透析液透析6h后，收集脂质体部分，以10的TritonX100破乳，经HPLC测定包裹在脂质体内的药物浓度C；另一份直接破乳，经HPLC测定姜黄素得到C0，按照公式计算出包封率（包封率CC0100）。
　　1。5。6脂质体稳定性考察
　　取制得的CURL和RDPCURL，分成两个实验组，每组平行3次，分别于3、7、15、30、45、60d后肉眼观察脂质体溶液变化，HPLC测包封率。
　　1。5。7体外释放度测定
　　采用动态透析法（dynamicdialysis），按中国药典2010版附录XC第三法（小杯法）测定释放度。精密量取制剂CURL、RDPCURL各0。5mL，经释放介质稀释至3mL，装于透析袋内（截留分子质量为8000u），两端扎牢，放入150mL释放介质中，释放介质为含有0。2十二烷基硫酸钠的人工胃液，37下姜黄素在此释放介质中的溶解度为80mgL1，满足漏槽条件。37恒温水浴搅拌（转速为100rmin1）。分别于0。5、1、2、4、6、8、12、24h各个时间点取样0。3mL，并及时补充等温的相同体积空白介质。微孔滤膜过滤，按照HPLC方法检测姜黄素含量，并计算累积释药百分率（）。
　　1。6姜黄素悬浮液和脂质体的体内分布
　　1。6。1色谱条件
　　C18色谱柱（250mm4。6mm，5m，大连依利特分析仪器公司）；流动相：乙腈4冰醋酸（4852），流速：1mLmin1，检测波长：430nm，柱温：25。
　　1。6。2样品预处理
　　将姜黄素溶解于1羧甲基纤维素钠中，配制成浓度为1gL1的CUR混悬液，制得的CURL和RDPCURL浓度均为1gL1，CUR、CURL、RDPCURL均按照姜黄素30mgkg1的剂量于小鼠尾静脉注射给药。取昆明小鼠，禁食12h，尾静脉分别注射CUR、CURL、RDPCURL，于0。25、0。5、1、2、4、6、8、12h各个时间点分别取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑（每个时间点3只），用生理盐水清洗后用滤纸吸干，剪碎，精密称重，加入1mL生理盐水，用组织匀浆器匀浆，加入1mL乙酸乙酯，涡旋3min，3000rmin1离心10min，精密吸取上清液，再加入相同体积的乙酸乙酯，萃取2次，合并上清液，氮气吹干，加入10倍体积的流动相，超声、涡旋使其充分溶解，过膜后进样。
　　1。6。3方法学考察
　　专属性：取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑各空白组织匀浆液0。3mL，样品处理后采用HPLC法分别进样测定空白样品、空白样品加内标及小鼠尾静脉注射给药后的样品。标准曲线：取小鼠空白组织匀浆液，精密加入姜黄素标准溶液，配制成1。6、3。1、6。2、12。5、25、50mgL1系列浓度的样品溶液，样品处理后，以姜黄素的峰面积与样品中姜黄素的浓度（C）进行线性回归。回收率与精密度：配制低、中、高浓度（3、12。5、50mgL1）的姜黄素质控样品，各5份，按样品处理项下方法处理，进样测定。以姜黄素的峰面积代入标准曲线方程，计算出姜黄素的浓度，与实际加入量比较，计算方法回收率，用以表示准确度；以相应低、中、高浓度的姜黄素对照品溶液直接进样，以质控样品中姜黄素峰面积与对照品溶液中姜黄素峰面积比较，计算提取回收率；1d内进样测定5次，连续测定5d，计算日内RSD和日间RSD。
　　2结果
　　2。1脂质体的制备和表征
　　2。1。1导向化合物的合成
　　生物质谱分析反应产物DSPEPEGRDP的结果如Fig1所示。RDP相对分子质量为3671，DSPEPEGNHS分子质量为3094，得到的产物DSPEPEGRDP相对分子质量约为6800，说明导向化合物制备成功。
　　2。1。2脂质体的粒径、zeta电位、分散度及包封率
　　CURL和RDPCURL粒径、zeta电位、分散度和包封率如Tab2所示。结果表明，CURL粒径为（81。205。13）nm，而RDPCURL经RDP修饰过后粒径为（98。566。97）nm，分散性良好，包封率均大于85，制备重现性较好。
　　2。1。3脂质体稳定性
　　CURL和RDPCURL4冰箱放置60d后，溶液依旧澄清透明，呈淡黄色乳光，与新制备时相比无明显变化。不同时间点测其包封率，可以看出RDP修饰对姜黄素脂质体包封率影响不大，60d后CURL和RDPCURL的包封率仍然在80左右，可见稳定性良好。
　　2。1。4导向化合物DSPEPEGRDP比例筛选
　　，当加入的DSPEPEGRDP为总摩尔量的1。0时，RDPCURL对U87细胞的抑制作用明显优于CURL（Plt；0。01）。随着DSPEPEGRDP比例的增加，U87细胞的存活率逐渐降低，这表明在脂质体的PEG链端连接RDP能增强对U87细胞的抑制作用，当加入比例达5。0时，RDPCURL对U87细胞的抑制作用最强，与0。5时相比差异有显著性（Plt；0。05）。当比例超过1时，RDPCURL对U87细胞的抑制变化不明显，表明继续增加DSPEPEGRDP的量并不能提高RDPCURL对U87细胞的抑制率。密度筛选实验结果表明，DSPEPEGRDP的加入比例能影响脂质体的靶向效率。出于实验效果和经济性考虑，选取加入比例为1。0进行以下的实验。
　　2。1。5体外药物释放
　　由于姜黄素在水中几乎不溶解，采用加入2十二烷基硫酸钠（SDS）的人工胃液为释放介质，考察姜黄素制剂的释药情况。CURL在前6h内大量释放，累计释放量接近60，而后进入慢速释放期，12h释放量约为80，而RDPCURL释放在该释放介质中较慢，6h后释放约45，24h后累积释放量不到80，表明RDPCURL有着更好的缓释作用。
　　2。2姜黄素悬浮液和脂质体的体内分布
　　2。2。1方法学考察
　　在上述色谱条件下，方法专属性良好，峰形良好，保留时间约为14min，组织中的内源性物质不干扰样品测定。样品中的姜黄素在1。562550mgL1线性关系良好（r0。9994）。方法回收率为（95。874。98），高、中、低3个浓度的提取回收率分别为（94。791。94）、（95。262。87）和（95。181。78）（n5），日内精密度和日间精密度小于15，均符合生物样品分析方法的要求。
　　2。2。2体内分布和脑靶向作用考察
　　小鼠尾静脉注射CUR、CURL、RDPCURL后不同时间各组织中的姜黄素。注射CUR后，随着时间的推移，姜黄素在各个脏器中含量逐渐减少，姜黄素大量分布在肺、肝、肾等脏器中，心、脾中也有少量分布，然而由于血脑屏障的作用，脑部并未检测到姜黄素。注射CURL后，由于易被网状内皮系统吞噬，姜黄素主要分布在肝、肾、肺中，在脑、脾中少量分布，而在心脏中没有检测到姜黄素。RDPCURL经尾静脉给药后大致分布与CURL类似，但在脑中检测到大量的姜黄素，并且在小鼠体内的滞留时间明显延长，24h仍然能在脑中检测到姜黄素。
　　3讨论
　　脂质体作为药物载体具有使药物被动靶向网状内皮系统、延长药物作用时间、减少药物不良反应、提高疗效等优点。表面经柔性高分子PEG修饰，增大了脂质体的空间位阻，同时提高了膜表面亲水性，使得其不易被网状内皮系统（reticularepithelialsystem，RES）摄取，因而PEG化的脂质体较普通脂质体更长效。
　　虽然脂质体经PEG修饰后能够延长在体内的循环时间，增加在肿瘤组织中的聚集，但是由于PEGdilemma现象的存在，阻碍了肿瘤细胞对脂质体的内吞，故在脂质体的PEG链端连接靶向配体如叶酸、转铁蛋白、抗EGFR抗体等，使得靶向配体与肿瘤细胞过度表达的受体特异性结合，通过配体受体特异性识别与结合作用，能够促进细胞对载体的吞，增加药物的抗肿瘤效果，并且可以定向地将药物运送到靶部位，实现对肿瘤组织的主动靶向。脂质体或者纳米粒子表面修饰特异性配体或受体，主动靶向特定肿瘤组织的文献已有大量报道。一些常见的细胞穿膜肽，如TAT、多聚Arg、转运素，已被证实能够在体外将核酸、蛋白等小分子物质转导入培养的细胞。Khafagy等研究发现，L型穿膜肽penetratin可以明显增加胰岛素的渗透性，从而使其穿过鼻膜，并不会对鼻吸收黏膜上的细胞完整性造成明显的破坏。据文献报道，另一个从狂犬病毒糖蛋白衍生出的一个小肽与多聚Arg连接后，能够输送siRNA靶向性地进入中枢神经系统，导致相关基因沉默。KaiPharmaceutical公司应用Tat引导蛋白激酶C抑制剂的蛋白调节子，用于脑缺血和急性心肌缺血的治疗，并且已于2007年进入了期临床试验。
　　然而，用细胞穿膜肽引导脂质体等纳米载体进入特定的组织，特别是脑组织的文献却并不多见。普通CPPs虽然能介导各类分子入胞，但是其缺乏细胞特异性，而本实验中所用的细胞穿膜肽RDP是一种来源于狂犬病毒糖蛋白RVG，并经过结构改造而得到的一种能靶向中枢神经系统、具有很强嗜神经性的衍生肽，同时具有良好的穿膜特性和对神经细胞的高度选择性。实验室前期研究已表明RDP能够引导核酸、多肽等小分子物质入脑，而本实验中通过体内分布实验证明了RDP连接的姜黄素脂质体在体内运输过程中没有发生断裂，确实能够携带包裹了姜黄素的脂质体入脑，不仅仅拥有理论意义，也具有潜在的应用价值。这为脑部疾病的治疗提供了新的思路。