独活寄生汤干预骨关节炎软骨细胞凋亡的机制研究

　　骨关节炎（osteoarthritis，OA）是力学和生物学因素共同作用下导致软骨细胞、细胞外基质以及软骨下骨三者降解和合成正常偶联失衡的结果，病理改变以关节软骨退变为主。正常的软骨细胞是维持细胞外基质稳定的必要条件，细胞凋亡是软骨退变的关键因素之一。基于独活寄生汤能有效改善OA的临床症状，探讨独活寄生汤干预软骨细胞凋亡的作用途径，为揭示其治疗OA的作用机制及药效物质基础提供新的研究思路。
　　独活寄生汤治疗OA的机制
　　OA属于中医痹证范畴，《黄帝内经》曰：风寒湿三气杂至合而为痹；《景岳全书》曰：痹者，闭也，以气血为邪所闭，不得通行而病也。OA病位在筋骨，肝肾为其病宗，肝藏血、主筋，肾藏精、主骨，肝肾亏虚，精血不足，筋骨失养，腠理空虚，风寒湿之邪易侵袭而为痹，肝肾亏虚为骨关节炎的发病根本，风寒湿邪为致病诱因，痰湿瘀血为病变过程的病理产物又是致病因素。肝肾精亏血少，肾阳衰微，无以充养温煦筋骨，则筋挛骨弱而邪留不去，痰湿瘀血逐渐形成，致痹证反复发作、迁延不愈。
　　独活寄生汤（唐代孙思邈《备急千金要方》）由独活、桑寄生、茯苓、细辛、肉桂心、防风、川芎、当归、牛膝、秦艽、人参、白芍、熟地黄、杜仲、甘草组成，具有祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血之功效。方中独活祛深伏骨节之风寒湿邪；桑寄生补肝肾，壮筋骨，祛风湿，共为君药。细辛、肉桂心辛散寒湿，温通经脉而止痛；防风疏风胜湿，透邪外出；秦艽搜筋肉之风湿，通经止痛；杜仲、牛膝补肝肾，强筋骨，止痹痛，共为臣药。熟地黄、当归、川芎、白芍补血调血；人参、茯苓益气健脾；甘草益气和药，共为使药。诸药合用，使外邪得除，肝肾得补，气血得充，切中骨关节炎的病因病机。
　　软骨细胞凋亡调控软骨退变的作用机制
　　细胞凋亡（细胞程序性死亡）是一个主动的、信号依赖的过程，并由基因控制的主动的、高度有序的死亡过程。在正常情况下，软骨细胞也存在着凋亡的现象，软骨细胞凋亡对维持关节软骨的形态结构及功能发挥重要的调控作用。不同年龄组动物关节软骨中细胞凋亡程度与年龄增长有关，软骨细胞的凋亡在成熟关节软骨形态结构的维持、再建和更新过程中也发挥重要的调控作用。若软骨细胞的凋亡超出一定的范围，会导致软骨细胞数量减少，软骨细胞数量的变化不仅引起软骨基质合成与分泌的减少，而且还能引起维持软骨基质合成与降解酶系统平衡的紊乱，最终引起软骨基质的质与量发生变化，软骨基质的这种变化又会促进软骨细胞的凋亡，从而导致软骨退变。目前研究表明，线粒体凋亡、内质网应激性凋亡、细胞自噬在OA的发病过程中发挥重要的调控作用。
　　1. 软骨细胞线粒体凋亡信号通路与软骨退变的关系 软骨退变是OA发生发展的一个重要因素，出现软骨细胞数减少、抗氧化防御能力下降、生长因子和细胞因子免疫应答改变及基因和蛋白表达模式改变等。促凋亡与抗凋亡信号之间的失衡是介导软骨细胞凋亡的关键，各种因素引起的凋亡信号传至软骨细胞内的作用位点，激活靶分子而产生酶级联效应，诱导细胞凋亡，线粒体凋亡通路是软骨细胞凋亡的重要途径之一。线粒体具有传递电子、氧化磷酸化、能量代谢、贮存Ca2+、抗活性氧化等重要生理作用。线粒体功能障碍时生成活性氧，过多的活性氧可引起线粒体损伤，从而释放促凋亡因子，导致细胞凋亡。活性氧可作用于线粒体内膜通透改变孔道（permeability transition pore，PTP），加速PTP开放，释放细胞色素C（cytochrome C，Cyto C）促进软骨细胞凋亡，而释放的Cyto C又改变线粒体内电子传递链的功能，引起活性氧生成增加。正常细胞中Cyto C位于线粒体内外膜之间，在电子呼吸传递链中起重要作用。当在凋亡发生时，Cyto C从线粒体释放入胞质，启动半胱氨酸蛋白水解酶活化，与半胱氨酸蛋白酶-9前体、凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）形成凋亡小体，并在脱氧腺苷三磷酸（deoxy-adenosine triphosphate，dATP）辅助下激活Caspase-9；Caspase-9激活Caspase-3，活化的Caspase-3瀑布式活化Caspase-2、6、8、10，而激活的Caspases最终活化脱氧核糖核酸酶（CAD/DFF45），水解核酸及细胞骨架，引起细胞凋亡。Bcl-2通过抑制Cyto C释放，降低活性氧生成，从而抑制凋亡。Bax为编码Bcl-2相关蛋白X的基因，具有诱导细胞凋亡的功能，Bcl-2/Bax之间的比例是调控细胞凋亡的关键因素。p53位于线粒体上的转录因子，能上调促凋亡基因的表达，下调抗凋亡基因的表达。p53基因表达产物的聚集使Bax表达增加，进而释放Cyto C并激活Caspase，引发细胞凋亡。
　　2. 内质网应激反应与软骨退变的关系 软骨内无血管和神经支配，代谢主要通过渗透作用，对缺氧、钙代谢紊乱、机械性压力、自由基侵袭等应激因素很敏感，易发生内质网应激反应，引发内质网相关性死亡。内质网在膜蛋白的合成、修饰和折叠及维持细胞内钙Ca2+的稳定等方面都发挥关键性作用。当机体细胞受到缺氧、饥饿、自由基侵袭及钙代谢紊乱等应激因素刺激时，内质网腔内未折叠蛋白增多或钙失衡，引发内质网应激反应。内质网应激感受蛋白（PEAK、ATF-6和IRE-1）介导的信号转导不仅是纠正内质网功能紊乱的重要机制，在强烈、持久应激刺激时，内环境紊乱无法纠正，内质网应激感受蛋白则会启动凋亡程序，诱发细胞凋亡。内质网应激引起的细胞凋亡异于其他凋亡路径，有其自身的信号通路，称为内质网相关性死亡途径，此途径包含内质网应激诱导CHOP/GADD153表达、C-JUN氨基末端激酶（JNK）活化和内质网特有的Capase-12蛋白水解酶活化。CHOP/GADD153是内质网应激特异的转录因子，PEAK、ATF-6和IRE-1的活化均能促进CHOP的大量产生。CHOP表达增加会下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，促进反应性氧中介物（ROIs）和减少细胞内谷胱甘肽生成，从而引发细胞凋亡。内质网应激时，活化的IRE1招募JNK和肿瘤坏死因子受体相关因子TRAF2，TRAF2激活细胞凋亡信号激酶1（ASK1），并形成IRE-1/TRAF2/ASK1三聚体，随后激活JNK，诱导细胞凋亡。Caspase-12位于内质网膜上，内质网Ca2+平衡的破坏或内质网未折叠蛋白的过量积聚均会诱导Caspase-12表达，同时也导致胞质内Caspase-7转移到内质网表面，Caspase-7激活Caspase-12，激活的Caspase-12可进一步活化Caspase-3，引发细胞凋亡。内质网上Bcl-2家族中抑凋亡蛋白则可调节网腔中游离Ca2+浓度，维持胞质内的Ca2+浓度在合适的水平，进而抑制细胞凋亡。
　　3. 细胞自噬与软骨退变的关系 细胞自噬（autophagy）是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过程，并利用降解产物提供能量和重建细胞结构，在维持细胞稳态和细胞生命活动等方面起重要作用。细胞自噬与凋亡间的关系较为复杂，目前研究表明，自噬标志性基因ULK、Beclin1、LC3在正常的关节软骨中有明显表达，退变软骨中自噬水平下降（其机制与溶酶体水解失败密切相关），导致退变软骨中自噬体清除减缓和毒性蛋白增加。自噬在骨关节炎软骨细胞凋亡中更倾向于保护软骨细胞，当细胞器受损时，细胞内自噬水平明显升高，以清除受损的细胞器，阻止细胞凋亡启动，但自噬过度或不足均可能导致自噬性细胞死亡。因此，细胞自噬一方面保护细胞，另一方面则可导致自噬性细胞死亡。Atg1、Atg6、Atg8（哺乳动物中的同源物分别称作ULK1、Beclin1、LC3）是自噬途径的3个主要管理者，分别充当诱导者、调节者、执行者的角色。在哺乳动物中，mTOR整合生长因子、营养分子、氨基酸和能量感受信号，调控细胞生长、增殖、营养运输、蛋白合成和自噬。细胞内营养缺乏时，mTOR活性受抑制，导致Atg家族成员激活，从而促进自噬泡形成；细胞内营养充足时，mTOR激活，从而抑制细胞自噬的发生。死亡相关蛋白激酶（DAPK）也是细胞自噬的重要调节因子，可使微管相关蛋白（MAP）1B磷酸化，进而使MAP1轻链3（LC3）-Ⅱ与自噬体膜结合。自噬蛋白Beclin1的BH3结构域与DAPK相互作用，可使BH3结构域磷酸化，从而阻断Beclin1与凋亡基因Bcl-2和凋亡抑制基因Bcl-xL相互作用，促进自噬发生。
　　独活寄生汤干预软骨细胞凋亡的机制
　　软骨细胞凋亡原因是多方面的，但最终都离不开凋亡相关因子的参与和调节。肝肾亏虚证存在不同程度的下丘脑-垂体-靶腺（肾上腺、甲状腺、性腺及胸腺）轴功能紊乱，影响机体的神经-内分泌-免疫系统功能，从而产生一系列的临床症状及体征。补肾柔肝药能多方位调节下丘脑-垂体-靶腺轴及神经-内分泌-免疫网络系统的功能，调节异常的细胞因子水平，上调性激素水平，保护软骨细胞，调节软骨基质的降解，参与调控软骨退变；补肾柔肝、祛风活血药通过影响凋亡信号通路，抑制促凋亡基因并促进抗凋亡基因的表达，从而抑制软骨细胞凋亡和促进增殖。因此，独活寄生汤作用机制可能是通过调节神经-内分泌-免疫系统、神经-内分泌-骨代谢系统的功能，调节线粒体功能、内质网应激反应、细胞自噬水平是独活寄生汤干预软骨细胞凋亡的重要作用途径。