浅谈重组糖蛋白激素的生物效价与质量控制

　　已发现的糖蛋白激素主要是由脊椎动物垂体前叶细胞合成和分泌的促黄体激素、促卵泡激素和促甲状腺激素，以及胎盘产生的人绒毛膜促性腺激素。被称为促性腺激素，通过调节性腺内配子发生和类固醇激素合成来促进辜丸和卵巢的功能，临床主要用于辅助生殖(促进卵泡发育、成熟及排卵)，治疗不孕不育症，调节甲状腺的生化和生理过程，促使甲状腺素的合成和分泌，临床用于该激素缺乏状况的检查或替补性短暂维持，在甲状腺疾病的治疗中扮演重要角色，如用于分化型甲状腺癌的诊断和随访，用于刺激清除残留甲状腺以及治疗甲状腺癌转移灶，用于刺激治疗非毒性结节性甲状腺肿以及提高低分化甲状腺癌化疗疗效等。过去，这类制品来源于垂体或尿液提取物，成分复杂。现在已实现基因重组技术生产，成份单一。重组人LH、重组人FSH、重组HCG和重组人TSH已先后被批准上市。生物效价是糖蛋白激素质量控制的重要指标，随着对高纯度重组产品理化结构与生物功能关系认识的不断深入和积累，研究发现糖蛋白激素制品的体内生物活性高度依赖糖基化的一致性，因此，现已逐步趋向于以理化指标的检测代替经典的生物活性测定方法。本文对影响生物效价的关键因素、质量控制中的关键指标进行梳理回顾，进而分析探讨糖基化修饰控制对生物效价、批间一致性的重要性。
　　1生物效价的定义
　　糖蛋白激素生物效价量值单位是一个抽象的概念，通过参照标准品，根据其在生物系统(体内或体外)产生特定生物反应的强弱，确定效价即生物活性。早期没有标准品时，通过测定其内分泌生理功能，定为动物单位，如HCG定义1个鼠单位为可从阴道涂片观察到雌幼龄大鼠发情所注射的HCG的量，从绝经妇女尿中提取的尿促性腺激素也是相同定义。其缺馅为:没有特异性，缺乏标准化，无法实验室之间比较[[9]。因此世界卫生组织通过建立国际标准品，确定国际单位，对第1次或国际参考品通过组织国际间协作标定，最终达成共识而定义IU数值。现在重组糖蛋白激素除:HCG外，rhFSH，rhLH和rhTSH都已有，除rhTSH的是定义的IU外，rhFSH和rhLH的IU由提取的FSH和LH标定而来。标准品一般原则为数值上保持连续性，由上一次标准品标定下一次标准品;每一标准品有专门用途，只供生物测定用或只供免疫测定用;使用时遵循同质原则，如对rhFSH产品要用rDNA的标准品检测，不能用尿源的。标准品或参考品的建立和溯源是生物效价量值测定和赋值的重要基础，生物制品活性或效价测定正是通过生物体外或体内试验方法并与标准品或参考品对照而得，重组糖蛋白激素生物类似药的研发过程中，生物活性检测被认为不仅是产品性质研究的一部分、批间分析鉴定的重要检测项，同时也是产品结构确证的有力补充，可反映产品的作用机制，从而与临床应用联系起来。
　　2糖基化的异质性与质量控制
　　糖蛋白激素家族是各由1个。哑基和1个p-亚基组成的异质二聚体，以非共价键结合，所有的。-ZL基都是相同的人。基长92个氨基酸，而和TSH的p哑基氨基酸残基各不相同糖链与肤链部分以共价方式结合，通常连接在天冬酞胺上，称为N寡糖侧链哑基的C末端比LH延长了24个氨基酸，称为竣端肤，其上含有4个糖链连接于丝氨酸残基，称为U寡糖侧链。重组糖蛋白激素异质性也是由于糖基化的不均一导致存在多种异型体，同一种激素，唾液酸含量、糖链长度、分枝类型与末端的变化，造成糖蛋白激素分子结构的异质性，LH与FSH存在近百种异型体。寡糖侧链具有甘露糖,酞葡萄糖胺组成的核心结构，延伸的分支末端有半乳糖、岩藻糖、唾液酸等，糖侧链比糖侧链更加多样复杂化，没有共同的核心结构唾液酸含量的变化是导致糖基化不均一的关键，重组糖蛋白激素的活性是由该混合物异型体结合到靶组织而达到的效果。指导原则(生物技术产品和生物制品的检验方法和可接受标准)对重组糖蛋白的异质性，指出这些异型体可能有活性，不会对产品的安全性和有效性产生不利影响，如已证明每批产品的异型体是一致的，就不必对每一种形式的活性、安全性和有效性进行评价，这些异型体决定了它们的质量，对异质体可当作相关物质加以鉴定，确保批与批间一致性。由此可见批间一致性是质量评价的关键。为保证批次间亚型分布的一致性，对相关物质和杂质(降解或聚合物)需进行必要的分析。如以反相高效液相色谱对重组糖蛋白激素进行肤图分析;采用RP}IPLC检测。和}-ZL基氧化产物;通过十二烷基硫酸钠嗜食丙烯酞胺凝胶和排阻高效液相色谱法检测游离亚基与多聚体含量;等电点聚焦电泳技术鉴别亚基分布，检测主色带和等电点范围等，并与内部对照品比较，对所有色带的物质进行控制。总之，控制产品相关杂质与物质的种类和含量是该类产品质量评价的重要内容，是保证批间一致性的前提。
　　3糖谱分析及值与效价关系
　　大量实验证实N寡糖侧链上唾液酸与糖蛋白激素的等电点、代谢清除率和生物活性密切相关，唾液酸含量越高，pI越低，生物活性越高，pI与体内生物活性间具有高度相关性(r=0.95}P0. 01)，以化学或酶制剂去糖基化后，皆丧失激素活性,LH和HCG去除唾液酸后，虽仍能与受体结合，具有体外活性，但却无体内活性，因已被从体内快速清除。高唾液酸结构，降低了糖蛋白激素的pI，低pI的糖蛋白在体内与肝网状内皮细胞表面特异性蛋白受体结合力降低，导致消除率降低，体内半衰期延长，如pI=4.27的rFSH比pI =5. 49的半衰期长1倍，而以神经氨酸酶去唾液酸后，HCG的半衰期从50 min降至1 min。质量标准的研究正是基于它们的物理化学性质及对效价的影响因素，关键是N梅氰糖侧链上唾液酸含量，因0-寡糖侧链分子上唾液酸化水平与生物活性的相关性小圈，因此N寡糖侧链的糖基化分析和唾液酸含量是保证重组糖蛋白激素具有生物效价的关键，糖谱分析是质量评价的重要内容，通过与对照品比对糖谱，及Z值计算，确保批间一致性。Z值是一假设参数，按不同种唾液酸比例评价唾液酸化程度，采用阴离子交换高效液相色谱和荧光检测仪分析糖谱，半定量分析相同唾液酸数量的寡糖百分比，即按糖链多聚糖所带电荷数，洗脱分离唾液酸化组分为中性唾液酸化组分及单、二、三、四、五唾液酸化组分，各自组分糖所占色谱峰面积除以所有组分糖总面积的百分比(A)乘以其相应电荷之和为Z值。由于糖侧链上唾液酸无生物活性，故Z值只需计算N寡糖链多聚糖，可通过一种高特异性酶肤N糖昔酶F，选择性在蛋白质N链接位点将完整的N}糖链作为葡萄糖胺类完整裂解下来，酶解消化释放出完整的N寡糖侧链聚糖。Z值具有高度的准确性(回收率91%一108 %)和精密度( RSD 2% )，是特征参数，代表N寡糖侧链上唾液酸化水平，能检测出不同生物活性的批次间糖基化的差异，效价低的Z值小，仅携带甘露糖无唾液酸的糖基化结构(Z = 0 ); rhLH和rHCG的Z平均值分别184,15。和150 }zo7，每一产品有其固定Z值范围，故糖蛋白激素质量标准中Z值不可缺少，如某公司生产的rhFSH产品3年内生产的120批Z值在177-200，表现出高度批次间一致性。因此糖谱和Z值成为评价糖基化水平和重组糖蛋白激素质量、保证其具有生物活性和批间一致性的重要指标。
　　4含量测定与效价关系
　　根据ICHQ6B规定:当药物的物理化学信息(包括高级结构)可以通过理化方法确定，并能证明与生物活性有相关性，以及存在完整的历史生产档案，含量与生物效价间形成稳定的转化值时，就可以用准确、精密的理化方法测定含量(林g或mg)代替生物效价。是测定重组促性腺激素蛋白含量的常用方法，精密度高;对rhTSH则以ELISA法测定含量。生物效价与含量之比为比活性，rhFSH ，rhLH ，rHCG比活性分别为10 000 9 000，大大高于提取产品，并且糖型结构也要简单的多。与受体结合后产生的生理效应是重组糖蛋白激素所有异型体的综合效应与制剂的量相关，受体结合反应依赖产品的准确剂量，而产品亚型分布、糖基化的一致性是前提。当经过长期考察批次间高度一致的产品，符合要求时，如某公司的rhFSH产品，7年内多批rhFSH原液，批与批次间高度一致，比活性稳定，呈正态分布，效价与蛋白含量间存在固定关系，故以含量标识回，取代在常规生产检定中误差大(RSD 20% )，耗费人力、物力，伤害动物的体内生物检定方法，以理化分析的方法代替，用于成品的质量控制。研发重组糖蛋白激素生物类似药企业，可积累数据，在确保批间一致性、工艺稳定条件下，使含量测定成为常规生产中的质量控制方法，而取代生物测定。
　　5展望
　　重组糖蛋白激素现阶段表达于CHO细胞，已实现大规模生产，细胞培养条件高度自动化、可控性强，纯化工艺稳定，制品纯度和比活性高，如rhFSH纯度可达到99 %，纯度和比活性高(99%)，未见免疫原性问题报道。通过生产过程的严格监控保证质量的稳定与批次间的高度一致性。
　　基于糖蛋白激素的构效关系，实现在CHO细胞的共表达，由此制备的长效rhFSH，商品名:已被批准上市;另有将FSH与免疫球蛋白的恒定区片段(Fc)融合，制备融合蛋白，得到长效rhFSH的报道。通过对它们的质量研究与评价，不断完善与生物效价相关的关键指标，来确保产品的一致性。