关于离体子宫张力测定在药物生殖毒性研究中的应用

　　前言
　　离体子宫平滑肌是生物活性组织，通过人工模拟的生理环境测定药物对子宫平滑肌舒张和收缩变化的影响，同时采用计算机生物信号采集处理系统，使子宫平滑肌收缩的复杂信号量化，绘制出给药前后子宫平滑肌收缩的图形并测得数据，为实验提供更加客观和准确定量的分析方法。无论对于妊娠动物还是非妊娠动物而言，经典的离体子宫药理学研究通常的方法是取子宫平滑肌片段，在体外加入不同浓度的药物，以测定给药前后子宫平滑肌张力的变化，可以测定药物对受体的亲和力，决定药物是激动剂还是拮抗剂，并能分析药物与受体的构效关系，反映药物在器官水平上的作用。但在胚胎- 胎仔发育毒性试验中，采用体外给药的方法无法模拟体内实验中受试物对妊娠子宫的影响，因此我们建立了动物体内给药模型，并在体外检测子宫平滑肌张力的方法，该方法未见文献报道。本研究根据《药物生殖毒性研究技术指导原则》，动物于GD6-15 接受不同剂量的受试物，利用体内给药妊娠的动物模型，GD20 选取妊娠动物的子宫平滑肌，检测其对刺激的舒张和收缩变化情况，以便同步分析药物对母体的毒性作用。
　　1 材料与方法
　　1.1 动物
　　健康SD 大鼠，SPF 级， 的体重180~200 g， 的体重200~220 g，购自上海西普尔- 必凯实验动物有限公司，生产许可证SCXK(沪)2008-0016，使用许可证SYXK(沪)2008-0027，饲养于上海市计划生育科学研究所(中国生育调节药物毒理检测中心)SPF 级动物房，保持室温20~26 ，相对湿度40~70%，自由进食饮水。
　　1.2 药品与试剂缩宫素注射液(上海禾丰制药有限公司，10 U/mL，实验前稀释至2 U/mL);硫酸镁溶液(配制0.96 mol/L);De-Jalons 液配方：NaCl 9 g，KCl 0.42 g，NaHCO3 0.5 g，CaCl2 0.06 g，葡萄糖0.5 g，蒸馏水1000 mL。
　　1.3 仪器RM-6240BD 多道生理信号采集处理系统;JZJ01H 型肌肉张力换能器;离体肠管及热板恒温器(均购自成都仪器厂)。
　　1.4 模型制备按雌雄2:1 于当日下午16:00 合笼交配，次日上午8:00 以后阴道涂片检查，查到精子或阴栓确定为妊娠第0 天，随机分组，妊娠第6~15 天给予不同浓度受试物。在妊娠第20 天，采用3%戊巴比妥钠麻醉孕鼠，剖腹取子宫，快速清除胎仔和胎盘组织，取其子宫体部平滑肌，修剪成约310mm 大小。
　　1.5 子宫平滑肌张力测定
　　开启多道生理信号采集处理系统，调零，调节水浴温度为35 ，连续通入混合氧(1 2 个气泡/ 秒);取上述方法制备的子宫平滑肌条，一端穿线固定于离体器官恒温水浴装置的浴槽底部，另一端穿线与记录装置相连;将已连接的子宫肌浸没于浴槽，浴槽中盛有6 mL 新鲜配置的De-Jalons 液，给予子宫肌1 g 的负荷，并保持;静置15 min 待波形稳定后，记录约5 min 正常波形;在浴槽中加入21 L 缩宫素注射液，记录约5 min 波形;清洗浴槽2-3 次后，加6 mL 营养液稳定2 min，加入50 L硫酸镁溶液，记录约5 min 波形;保存文件，分析波形。
　　1.6 统计学处理
　　以RM-6240BD 生物机能实验系统描记子宫平滑肌的收缩活动，测定子宫平滑肌的收缩幅度、频率及张力(幅度频率)。实验数据均以均数标准差(xs)表示，采用SPSS 11.5 统计分析软件处理实验数据，多组间比较采用单因素方差分析，以P0.05 为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 最佳缩宫素和硫酸镁溶液刺激剂量的确定给予未接受受试物的孕鼠子宫肌0~0.01 U/mL 缩宫素时，表现为随剂量升高，离体子宫的收缩增强，当剂量超过0.01U/mL 时，随剂量升高，张力持续增高，最后可致强直性收缩。综合选择缩宫素浓度为0.007 U/mL，可使子宫平滑肌呈较好的节律性收缩。
　　给予0~0.01 mol/mL 硫酸镁时，表现为随剂量升高，对离体子宫的抑制作用增强，当剂量超过0.01 mol/mL 时，离体子宫的收缩明显受到抑制，表现为图形不再波动。综合选择硫酸镁浓度为0.008 mol/mL，可较好地抑制子宫平滑肌。
　　2.2 缩宫素和硫酸镁对受试物处理的妊娠子宫平滑肌幅度、频率和张力的影响
　　未加入任何刺激前，随着受试物剂量的增加，妊娠子宫平滑肌的幅度、频率和张力呈逐渐上升的趋势，但各剂量组与溶媒对照组相比均未见明显差异(P加入缩宫素后，各剂量组妊娠子宫平滑肌活动频率和张力有增加的趋势，但各组的幅度、频率和张力与溶媒对照组相比均未见统计学差(P加入硫酸镁后，各剂量组妊娠子宫平滑肌的活动幅度、频率和张力均呈现降低的趋势，但与溶媒对照组相比也未见统计学差异(P0.05)。
　　3 讨论
　　离体子宫是药理学实验中常用的标本，利用妊娠或非妊娠大鼠子宫平滑肌研究各种药物的影响，已经有不少报道，主要是离体情况下给予不同浓度的药物，测定离体子宫对不同浓度药物的反应。这种子宫平滑肌的异常收缩或舒张，通常是在药物筛选阶段进行，考察药物的药效作用或药理作用。药物的非临床生殖毒性安全性评价研究所采用的是体内给药动物模型，妊娠期给予不同剂量的药物后，可能会对妊娠子宫的收缩或舒张造成不同程度的影响，从而影响妊娠的结局，研究给予药物后的妊娠子宫收缩就显得非常重要。因此，根据药物的特点，我们在评价生殖毒性时增加了子宫平滑肌的检测。但在生殖毒性研究中，评价这种子宫平滑肌的异常收缩或舒张可能造成不良的后果，几乎未见报道。本研究在药理学研究的基础上，分别探讨了加入缩宫素和硫酸镁后，不同剂量组妊娠动物模型离体子宫平滑肌张力的变化。
　　缩宫素的结构与人体垂体后叶产生的天然催产素相同，能直接兴奋子宫平滑肌，刺激其节律性收缩，为子宫平滑肌兴奋药。本研究利用子宫平滑肌的特点，采用缩宫素注射液，刺激离体子宫收缩。经过预试验，选择0.007 U/mL 作为统一的试验标准剂量，可使妊娠离体子宫平滑肌呈较好地节律性收缩。硫酸镁中的镁离子能直接作用于子宫肌细胞，可拮抗钙离子对子宫肌收缩作用，抑制子宫收缩，为子宫平滑肌抑制药。在本实验室条件下，硫酸镁终浓度为0.008 mol/mL 时，能较好地抑制妊娠离体子宫平滑肌的收缩。
　　本研究方法为配合胚胎- 胎仔发育毒性试验所进行的子宫平滑肌张力检测，该实验中受试物对母鼠的毒性主要表现为中高剂量组母鼠体重增长缓慢和高剂量导致的宫外增重减少，对胚胎- 胎仔发育毒性表现为高剂量活胎率降低，吸收胎率增加。实验结果表明子宫平滑肌对缩宫素和硫酸镁的刺激显示出剂量- 反应增加趋势，考虑到受试物中含有红花，红花有活血化瘀、使子宫紧张性和兴奋性增加的药理作用。故可认为增加该指标的检测可以更好的反映受试物的生殖毒性作用，更加全面的评价受试物的特点。