贞观二十三年（649年），唐太宗病逝于行宫翠微宫，遗命长孙无忌与褚遂良辅政，太子李治悲痛欲绝，抱着长孙无忌的脖子痛哭，长孙无忌请李治处理政事以安内外，李治仍哀哭不止，无忌道：“陛下将宗庙社稷交付殿下，您怎能只知哭泣？”他秘不发丧，并让李治迅速赶回长安。
　　六月，太子李治继位，是为唐高宗，长孙无忌进拜太尉、同中书门下三品，仍兼任扬州都督，主持朝政，当时，长孙无忌以元舅的身份辅政，每有进言，唐高宗都优先采纳，曾有洛阳百姓李弘泰诬告长孙无忌谋反，高宗立即下令将其处斩。
　　永徽四年（653年），唐高宗命长孙无忌审理房遗爱谋反案，吴王李恪名望素高，且与长孙无忌有旧怨，长孙无忌欲借机诛杀李恪，以绝众望，便诬称李恪也参与谋反，二月，房遗爱等人被处斩，李恪也被赐死，死前大骂：“长孙无忌窃弄威权，陷害良善，祖宗有灵，必让其宗族覆灭。”江夏王李道宗、驸马都尉执失思力因与长孙无忌不和，也被流放岭南。
　　永徽五年（654年），唐高宗欲废黜王皇后，立武昭仪（武则天）为皇后，他担心大臣不从，便与武则天到长孙无忌家中饮宴，赏赐金宝缯锦十车，又任命无忌的三个庶子为朝散大夫，并以皇后无子来暗示无忌。
　　长孙无忌却假装不明白高宗的意思，顾左右而言他，高宗怏怏而归，后来，武则天的母亲杨氏多次到长孙无忌家中请求，礼部尚书许敬宗也加以劝说，但都被无忌正色拒绝。
　　永徽六年（655年），唐高宗决定废后，召长孙无忌、李勣、于志宁、褚遂良入内殿商议，李勣称病未去，于志宁噤不敢言，褚遂良则激烈反对，长孙无忌虽未明言反对，但却在一定程度上支持褚遂良，但唐高宗最终还是将王皇后废为庶人，改立武则天为皇后，武则天因长孙无忌接受赏赐却不肯支持自己，对他怀恨在心。

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