视频大赛优秀作品昆虫显微注射方法

　　显微注射方法是在高倍倒置显微镜下，利用显微操作器，控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置，用来进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是昆虫基因功能研究的有力手段，作为一种新型的、特异性强、对环境相对友好且能带来经济效益的技术，目前逐渐成为发现和验证防控害虫基因的研究方法之一。目前常用的RNA干扰呈递方式有注射法和饲喂法，一般情况下，注射法干扰效率高，实验结果稳定。
　　稻飞虱是亚洲许多地区的主要水稻害虫。稻飞虱体积小，需要在体视镜下进行操作，因此对实验操作者的手眼配合能力和注射熟练程度有一定的要求。本视频以小型昆虫稻飞虱为例，应用显微注射方法，将dsRNA递送至昆虫体腔，以达到基因沉默的目的。该方法在昆虫基因研究中应用广泛，不过微量注射对昆虫虫体本身有一定的损伤，需要先使用二氧化碳将试虫麻醉，然后选择昆虫体壁较薄的节间膜位置进行注射。注射部位通常选择在前胸和中胸之间，如图1所示。详细的操作方法和注意事项，请访问下方的视频链接。
　　图1。稻飞虱若虫注射示意图。：前胸和中胸连接处；：腹部第二节和第三节之间位置；：腹部第三节和第四节之间位置
　　一、样品信息与耗材仪器
　　1。样品信息
　　稻飞虱若虫
　　2。试剂和耗材
　　50mL离心管、WPI玻璃毛细管、眼科显微剪刀、装有液体石蜡的注射器、2琼脂板、0号毛笔、装有新鲜水稻苗的一次性透明塑料杯WPI注射针、吸虫器、水稻苗、显微镜、注射器、二氧化碳气瓶（麻醉）
　　3。仪器和软件
　　显微操作仪器：Nanoject4micoinjectiondevice（MicroSyringePumpController；WorldPrecisionInstruments，USA）
　　二、实验操作
　　昆虫显微注射方法以稻飞虱为例
　　该作品在Bioprotocol第三届生物实验短视频大赛中荣获二等奖，欢迎点击链接查看原视频：昆虫显微注射方法以稻飞虱为例BIO101
　　1。剪针
　　将拉好的毛细玻璃管柔软尖端剪掉，保留合适硬度的针尖。装液体石蜡，用注射器将液体石蜡推进、装满玻璃针管。装针，首先旋下泵头套，将玻璃针的尾端从泵头套前端装入，然后，将3个垫圈按照黑白黑的方式，依次将大孔径黑垫圈套进玻璃针尾部，小孔径黑色垫圈套进注射泵钢针，白色垫圈小孔径朝向钢针，套在钢针上。最后，将玻璃针尾部朝向钢针，将钢针插入玻璃针，用纸巾吸走溢出的液体石蜡。缓慢推进泵头套和玻璃针，将泵头套连同玻璃针安装在注射泵上。
　　2。仪器设置
　　打开显微注射泵，进行系统设置。选择远程控制，即使用脚踏板控制。选择钢针方向，设置为推出模式。单击脚踏板，注射泵将钢针排出，推出大约13液体石蜡。
　　3。吸取dsRNA
　　如dsRNA等需要注射进入试虫体内的试剂。吸入体积约是排出液体石蜡的体积。吸入的液体与液体石蜡有明显分层。
　　4。麻醉试虫
　　使用二氧化碳熏虫，约30s。
　　5。显微注射
　　使用体视镜，2倍放大。将玻璃针尖插入试虫胸部前胸和中胸或者中胸和后胸的中间位置，单击脚踏板，完成注射。注射完成后，用0号毛笔将试虫推离玻璃针，放置在琼脂板的另一边。随后，通过移动琼脂板，在显微镜视野中进行下一头试虫的注射。直至完成琼脂板上所有试虫的注射，用吸虫器将试虫转移进50mL离心管，等待试虫苏醒。
　　6。卸针
　　完成注射后，旋高注射泵，移走琼脂板。缓慢拧下泵头套，拿下玻璃针。用玻璃针尾部挤推出3个垫圈，并归位。将使用完的玻璃针丢弃在玻璃垃圾桶中。然后，将泵头套复位。最后，收回钢针。
　　7。关机
　　关闭体视镜光源，关闭显微操作泵操作器。关闭二氧化碳气瓶，先关闭主阀，放出气管中剩余气体，气压为0后，关闭分阀，关闭操作阀。
　　8。转移试虫
　　试虫苏醒后，将试虫转移至新鲜水稻苗上饲养。以备下一步实验。完成显微注射。
　　三、注意事项
　　1。每次使用二氧化碳麻醉稻飞虱若虫数量不宜过多，1520头为宜。
　　2。稻飞虱若虫接受二氧化碳麻醉不宜超过2次。
　　四、作者单位与课题组简介
　　单位简介
　　南京农业大学植物保护学院成立于2000年，肇始于1902年三江师范学堂的病理学，从金陵大学1916年设立的植病组、昆虫组以及国立东南大学1921年创立的中国第一个植物病虫害学系发展而来，是我国近代植物病理学、昆虫学及植物检疫事业的发祥地之一。
　　课题组简介
　　杀虫剂药理与神经毒理学实验室成立于2006年，是以昆虫神经系统中的杀虫剂靶标为主要研究对象，以靶标与杀虫剂之间的相互作用为主要研究内容，在探索靶标药理学特性的基础上，建立靶标与杀虫剂互作模型，作为害虫抗药性机理研究、杀虫剂作用机理和选择性机理研究技术平台，为高效高选择性新型杀虫剂开发提供生物学支撑。
　　五、参考文献
　　1。Liu，Z。，Williamson，M。S。，Lansdell，S。J。，Denholm，I。，Han，Z。，Millar，N。S。，2005。AnicotinicacetylcholinereceptormutationconferringtargetsiteresistancetoimidaclopridinNilaparvatalugens（brownplanthopper）。Proc。Natl。Acad。Sci。USA102，8420e8425。
　　2。Liu，S。H。，Ding，Z。P。，Zhang，C。W。，Yang，B。J。，andLiu，Z。W。（2010）。GeneknockdownbyintrothoracicinjectionofdoublestrandedRNAinthebrownplanthopper，Nilaparvatalugens。InsectBiochemMolec40，666671。
　　Bioprotocol简介
　　Bioprotocol于2011年在斯坦福大学创建，致力于搭建全球权威的、高质量的生物实验方案分享平台，以助力科学发现。Bioprotocol期刊是Bioprotocol旗下的一份同行评审的国际学术期刊，发表高质量的生命科学实验方案，旨在提高科研的可重复性。至今，Bioprotocol已发表了来自全球上万名优秀科研工作者（包括多名诺贝尔奖获得者）的4000多篇实验方案，并且同Science、eLife等12家国际权威科学杂志建立长期合作关系，共同促进生命科学研究的可重复性。2019年Bioprotocol期刊已被PubMedCentral，ESCI收录。