来看如何简单可靠灵敏特异测定HO释放

　　该篇实验方法已经在eLife文章Mesenchymalstromalcellagingimpairstheselforganizingcapacityoflungalveolarepithelialstemcells中验证过。原作者将该方法的详细版本发表在Bioprotocol期刊，欢迎大家进入Bioprotocol期刊直接与作者交流。简介
　　在这篇Bioprotocol文章中，来自美国伯明翰大学和杜兰大学的研究人员为我们描述了一种简单、可靠、灵敏和特异的用于检测和定量活细胞、类器官或组织释放的HO的方法。
　　亮点
　　1。该方法与目前利用荧光染料检测细胞内HO的方法不同，该方法具有特异性和灵敏度，检测范围在纳摩尔范围内。
　　2。该方法能够在活细胞、类器官或组织中进行HO的快速检测，可以在几分钟到几小时内计算出HO的稳态释放速率。
　　3。该方法成本低，储存保质期长，相对于商业试剂盒来说更加经济实用。
　　背景介绍
　　活性氧（ROS）在自然界中普遍存在，在生物系统中作为信号分子发挥作用，还可能导致几种病理生物疾病状态下的氧化应激。因此，对ROS的研究在生命科学领域至关重要。众所周知，ROS可能来自细胞内多种酶促和非酶促代谢反应。细胞内的细胞器如线粒体、内质网、微粒体和过氧化物酶体都含有产生ROS的酶，且细胞主要通过超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的作用来对抗过量的ROS。
　　目前已公认，ROS诱导调节细胞信号转导的蛋白质翻译后修饰，被称为氧化还原信号。在过去的25年里，NADPH氧化酶（NOX）家族的发现进一步阐明了氧化还原信号传导领域。这些新型酶的主要催化功能是调节ROS的生成，特别是超氧阴离子（O。）和过氧化氢（HO）的生成。由于HO可以直接影响介导信号转导的蛋白质中易感的硫醇基团，因此HO也成为一种关键的信号分子。NOX在生物膜（包括质膜）中的定位使得能够检测活细胞培养物组织表面的NOX活性。然而，对于HO来说，细胞外释放也可能反映细胞内HO的产生，这种产生能够跨质膜扩散，或通过水通道蛋白通道运输。
　　在这篇protocol中，作者描述了一种简单、可靠、灵敏和特异的方法，用于检测和定量活细胞、类器官或组织释放的HO。在这个检测体系中，HO的特异性是基于HO与含过渡金属的血红素过氧化物（如辣根过氧化物酶HRP）在高速率常数下的高反应活性，生成的中间络合物能够催化一系列取代酚类化合物的二聚化，作者利用高香草酸（3甲氧基4羟基苯乙酸，HVA）在HO和HRP的存在下转化为强荧光二聚体的特性已成功地检测了NOX4的活性。
　　步骤节选
　　stepA。Cellbasedassay
　　Day1：Seedcells（50，000cellswell）ina24welltissuecultureplate，incompleteDMEMmediawith10FBS，1PenicillinStreptomycin，and2。5mMLGlutamine；incubateat37Cinahumidifiedincubatorwith5CO。
　　Day2：SerumstarvecellsbyreducingFBSconcentrationto0。05overnight（16h）。
　　Day3：Insomecases，stimulationwithacytokine，suchasactivatedTGF1（2ngmL），maybeaddedtoinduceenzyme（s）thatgenerateextracellularHOforvariabledurationsoftime。
　　Day3or4：AssayforHOrelease（seeFigure1）。
　　1。Aspiratemediafromallwells，andwashgentlywith1mLofHBSSwithoutphenolred。
　　2。Add0。5mLofassaymediatoeachwell，includingthreeblankwellscontainingnocells。
　　3。Incubateat37CintheCOincubatorfor12h（tinminutes，seestep2underDataanalysis）。
　　4。Attheendoftheincubationperiod，transferthecellfreesupernatanttoinpidual13100mmglasstubes；addHBSStotheremainingcellsforcellcounting（todeterminethenumberofcellswell，ninmillions；seestep2underDataanalysis）。
　　5。Add1。1LofNaOHEDTAalkalizationsolutiontotheglasstubescontainingassaymedia；vortex，andallowtositfor5min。
　　6。Transfer300Lofalkalizedassaymediumfromthisintoa96wellblackbottomplate；measurefluorescence（relativefluorescenceunits，RFU）atexcitationandemissionwavelengthsof321nmand421nm，respectively。
　　Figure1。SchematicofworkflowtodetermineratesofHOreleaseinacellororganoidbasedassay。
　　stepB。Standardcurve
　　1。Add1mLofthesameassaymedium（usedaboveforcellincubation）insix13100mmglasstubes。
　　2。StandardconcentrationsofHO（05M）canbemadebyadding1：1，000dilutionstoeachofthetubesinstep1above，includingablank（noHO）。
　　3。Thesamplesarevortexed，andthereactionallowedtoproceedatroomtemperaturefor5min。
　　4。Add2。2LofNaOHEDTAsolutiontoeach1mLtube（instep2），vortexagainandsitfor5min（togetherwithcellbasedsamplesinstep5above，underCellbasedassay）。
　　5。Transfer300Lfromeachstandardconcentrationtoa96wellplate，andreadfluorescenceasdescribedinstep6above（underCellbasedassay）。
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　　Bioprotocol简介
　　Bioprotocol于2011年在斯坦福大学创建，致力于搭建全球权威的、高质量的生物实验方案分享平台，以助力科学发现。Bioprotocol期刊是Bioprotocol旗下的一份同行评审的国际学术期刊，发表高质量的生命科学实验方案，旨在提高科研的可重复性。至今，Bioprotocol已发表了来自全球上万名优秀科研工作者（包括多名诺贝尔奖获得者）的4000多篇实验方案，并且同Science、eLife等12家国际权威科学杂志建立长期合作关系，共同促进生命科学研究的可重复性。2019年Bioprotocol期刊已被PubMedCentral，ESCI收录。