海星生物细胞培养换液传代冻存复苏操作说明

　　细胞换液
　　所需试剂细胞完全培养基
　　推荐使用海星生物细胞配套专用培养基
　　1。细胞处理后的第二天，在显微镜下观察细胞状态，如死细胞较多且细胞密度较低，需要进行换液操作。
　　（1）悬浮细胞请在高倍镜下观察，一般而言，活细胞轮廓圆润、界限清晰、透明度大、折光性强。如细胞活率较高，则继续正常培养。
　　（2）贴壁细胞如观察到较多细胞漂浮，请在高倍镜下观察，判断漂浮着的细胞是死细胞还是暂未贴壁的活细胞。如细胞活率较高，则继续正常培养。
　　（3）半贴壁细胞正常培养会有部分细胞漂浮，属正常现象。请在高倍镜下观察，判断漂浮着的细胞是否是死细胞。如细胞活率较高，则继续正常培养。
　　2。如需换液，参考以下步骤：
　　（1）悬浮细胞：收集培养容器中的所有细胞悬液。250g离心4min后弃去上清。使用预热的完全培养基重悬，将细胞悬液接种到合适的培养容器中。
　　（2）贴壁细胞：直接弃去培养容器中的上清，添加预热的完全培养基至原培养容器中。
　　（3）半贴壁细胞：收集培养容器上清中的所有细胞，250g离心4min后弃去上清。使用预热的完全培养基重悬，接种至原培养容器中。
　　3。之后，每23天更换一次完全培养基，后续根据细胞生长密度和状态传代或冻存。
　　注意：若发现异常情况，应及时排查原因，并与我们联系。
　　细胞传代所需试剂
　　细胞完全培养基
　　贴壁和半贴壁细胞需要同时准备以下试剂：
　　0。25Trypsin0。04EDTA（货号：GUTPR001，以下简称胰酶）
　　1PBS（货号：GUPBR001，以下简称PBS）
　　1。预热完全培养基（贴壁和半贴壁细胞还需要预热胰酶和PBS）。
　　2。细胞收集。
　　（1）悬浮细胞直接收集培养容器中的所有细胞悬液至离心管中。
　　（2）贴壁半贴壁细胞需要对细胞进行消化处理，步骤如下：
　　用PBS洗涤细胞2次。洗涤过程中注意动作轻柔，清洗全面。
　　贴壁细胞直接弃去培养容器中的培养上清。用PBS洗涤细胞2次，洗涤后的PBS直接弃去，无需保留。
　　半贴壁细胞需收集培养容器中的培养上清至离心管中。用PBS洗涤细胞2次，洗涤后的PBS需收集至离心管中。
　　加入胰酶，迅速铺匀，确保其充分接触细胞表面。
　　显微镜下观察消化情况，约7080细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养容器底面。立即加入胰酶双倍体积的完全培养基，轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化。
　　吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来。将细胞悬液转移至离心管中。
　　3。PBS洗涤培养容器12次，收集所有细胞悬液至离心管中。
　　4。收集的所有细胞悬液250g离心4min。
　　5。离心后去除上清。加入2mL预热的完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。
　　6。将细胞按（2。54。0）104个活细胞cm2接种至适宜的培养容器内。
　　注意：如未计数，也可按照适宜比例进行传代，但请根据细胞实际生长情况灵活调整传代比例。
　　7。摇匀细胞，将培养容器放入细胞培养箱中。
　　8。后续根据细胞生长密度和状态进行补液（悬浮细胞）换液（贴壁半贴壁细胞）、传代或冻存等操作。
　　细胞冻存
　　所需试剂冻存液
　　推荐使用海星HyCyteTM一步冻存液（即用型、无血清、无需程序降温）
　　货号：GUCPR201
　　1。待细胞生长至可传代的密度，即可准备冻存。
　　2。消化细胞，取少量细胞悬液计数。细胞悬液经250g离心4min。
　　3。离心后去除上清，用适量4预冷的冻存液重悬细胞。将细胞按比例或数量分装至冻存管中。一般冻存密度为（1。02。0）106个mL。
　　注意：细胞长时间在非培养条件下放置会严重影响细胞的状态。如离心后用冻存液重悬计数，请将细胞放置于4冰箱内，以减弱细胞代谢，较好的保持细胞状态。
　　4。如使用海星一步冻存液，冻存管直接竖直放入80冰箱即可完成一步冻存。如使用程序冻存液，需将冻存管放入提前预冷的程序降温盒后放入80冰箱。
　　5。24小时后可将冻存管转移到液氮进行长期保存。
　　注意：细胞不可长期保存在80冰箱中。建议24h后尽快转移至液氮中。
　　细胞复苏
　　所需试剂细胞完全培养基
　　推荐使用海星生物细胞配套专用培养基
　　1。开启37水浴锅。预热完全培养基，提前将细胞从液氮中取出，放于80冰箱，让冻存管中液氮挥发。
　　2。洁净工作台内准备15mL离心管，加入5mL预热的完全培养基。
　　3。从80冰箱中取出细胞。快速将冻存管置于37水浴锅内，快速晃动，使冻存液迅速融化。
　　注意：融化过程必须晃动冻存管，保证冻存液融化均匀。晃动时应避免水没过管盖增加污染风险。
　　管内冻存液融化至只剩一个约2mm直径的冰晶时，可停止水浴。继续晃动冻存管至冰晶融化。
　　4。用75酒精消毒冻存管表面。在洁净工作台内小心开盖，尽量避免气泡溢出，轻柔吹打数次，转移至预先准备的离心管内。用少量完全培养基洗涤冻存管12次，一并收集至离心管内。
　　5。250g离心4min。离心后去除上清。加入2mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。（如有台盼蓝可取少量细胞悬液进行染色计数）
　　6。将细胞平均接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中，加入足量完全培养基，摇匀细胞，将培养容器放入培养箱中培养。
　　7。复苏次日，观察细胞状态并换液，具体操作见细胞换液。
　　注意：贴壁半贴壁细胞接种24h内不应扰动。部分细胞贴壁较慢，复苏后48h不应扰动，具体注意事项见相应细胞说明书。
　　细胞处理原则严格的无菌环境。务必保证实验室、超净台生物安全柜和培养箱的清洁。
　　规范的操作方式。请按照操作说明描述的方式操作，注意操作细节。
　　需要合适的、质量可靠的实验耗材和试剂。使用的试剂必须经验证可靠，适宜细胞生长且批间差异小。