ScienceAdvances土壤细菌群落原位代谢和碳利用效率

　　导读
　　基因组学和纯微生物的代谢途径的研究表明：在复杂环境下，微生物群落的代谢方式和碳利用效率呈现多样化特征，然而，微生物的表型特征（真实代谢过程）受环境因素的影响较大，复杂环境中微生物群落甚至个体间的原位代谢途径更是研究的难点。
　　微生物代谢流是一种广泛应用于代谢工程、人类疾病诊断、药物开发等领域的研究技术，通过评估微生物代谢网络上的代谢流/碳通量，挖掘关键的代谢通路，揭示代谢网络上下游的调控机制，以提高对微生物胞内动态代谢过程的认识，从而进一步厘清微生物的代谢过程以及与环境相互作用的关系。
　　目前微生物代谢流分析技术主要研究对象为纯的微生物菌株，通过添加不同位置13C标记化合物（例如[1,6-13C2]葡萄糖和[U-13C6]葡萄糖）培养微生物，然后测定微生物蛋白质来源氨基酸分子碎片13C的标记峰度。通过非线性优化算法，比较实验测得的氨基酸片段13C峰度与代谢网络上模拟的氨基酸13C的峰度，从而定量评估微生物代谢网络上代谢流的大小。
　　这种方法称为13C-代谢流法（13C-Metabolic Flux Analysis），已经成为微生物代谢流评估的＂金标准＂（Long and Antoniewicz, 2019, Nature Protocol ）。
　　特定位置13C标记能够揭示代谢流的核心原理是：微生物利用有机物时，碳原子在代谢网络上的流动方向和大小会因为代谢通路的不同而变化，例如葡萄糖分子中C1位置的碳原子经过戊糖磷酸途径（PP）会直接氧化成CO2分子，而在经过糖酵解途径（EMP）时，则保留在乙酰辅酶A的甲基上面，从而进一步被保留下来（图1 ）。
　　▲图1. 葡萄糖转化成乙酰辅酶A过程中碳原子的流动方向 。ED、EMP和PP分别为糖降解的三种主要途径Entner-Doudoroff途径、糖酵解和戊糖磷酸途径。ED途径指的是Entner-Doudoroff途径，由Nathan Entnert和Michael Doudoroff科学家发现，又称2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸途径（KDPG）。
　　13C-代谢流法通常适用于代谢途径清楚的模式菌上（比如大肠杆菌株），对于复杂环境微生物群落下微生物组或者微生物种间代谢流的特征却未见报道。
　　磷脂脂肪酸（PLFA）是生物地球化学研究领域常用的生物信息学指标，不仅可以指示微生物群落的组成信息，并且其13C组成可以用来揭示微生物利用有机碳的方式。基于PLFA的稳定13C同位素标记技术，甚至可以定量化揭示微生物参与碳循环的过程。
　　因此，开展基于PLFA生物信息学的代谢流分析技术应当可以用于研究环境微生物群落的代谢流。
　　2020年，我们团队开发了基于PLFA的微生物代谢流评估模型（C13-PLFA-MFA; Wu et al., 2020, Geochimica et Cosmochimica Acta ）。该模型应用在了地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis 和荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens 利用葡萄糖的代谢流研究上得到了很好的应用，并且与前人的研究结果一致，充分证实了该方法的可靠性。
　　▲图2. 磷脂脂肪酸的代谢流模式统计分析. A, 非度量多维尺度分析; B, 聚类分析. V1到v18及br1和br8代谢网络的生物反应（具体细节见文章的附件）。
　　为了进一步拓展该方法的应用，吴伟超研究员和来自德国哥廷根大学、德国图灵根大学、美国北亚利桑那大学和中科院昆明植物所的研究人员进行合作，研究了土壤环境中微生物群落的代谢流。
　　通过平行添加6种单13C标记葡萄糖（包括[1-13C]、[2-13C]、[3-13C]、[4-13C]、[5-13C]、[6-13C]葡萄糖）到土壤中，在15℃培养箱里培养10天。培养结束后，按照常规PLFA提取方法，得到脂肪酸甲酯化合物。
　　气相色谱质谱联用仪上，测定PLFA经过电离后产生的乙酸和丙酸基团分子碎片的同位素分布特征。经过同位素校正后，可以得到PLFA的乙酸和丙酸基团的13C标记程度（数据处理方式见Wu et al., 2020, Geochimica et Cosmochimica Acta ）。将测试结果应用于C13-PLFA-MFA代谢模型进行运算，可以得到单个PLFA背后微生物在代谢网络上的代谢通量。
　　经过聚类分析，土壤微生物群落中至少存在着三种不同类型微生物组：革兰氏阳性细菌组A、革兰氏阳性细菌组B和革兰氏阴性细菌组，它们的代谢流特征明显不一样（图2 ）。根据这一分类特征，该研究对这三组微生物的关键代谢通路进行代归纳分析，发现： 革兰氏阳性和阴性细菌利用葡萄糖的方式明显不一样，特别是革兰氏阴性细菌是主要利用ED和PP途径，而革兰氏阳性细菌主要利用PP途径（图3A ）。值得注意的是部分革兰氏阳性细菌ED途径是活跃的，尽管它们的重要性不及EMP和PP途径。 革兰氏阳性细菌和阴性细菌在下游代谢途径TCA通路上呈现明显的差异性（图3B ），这种差异性可能反映的是代谢能量的差异，因为TCA是重要的产能途径，比如还原型辅酶Ⅱ（即NADPH）。 三组微生物组在碳的利用效率方面也具有明显的差异，其变化范围在0.31-0.65（图3C ）。
　　▲图3. 土壤微生物群落的主要代谢途径的通量和碳利用效率。 Gram Pos_A、Gram Pos_A和Gram Neg分别指示革兰氏阳性细菌A组、革兰氏阳性细菌B组和革兰氏阴性细菌。这三组也对应图2A中聚类分析得到的A、B和C三组。
　　研究意义与启示
　　该研究通过实验的方法定量了环境微生物群落内部多样化的代谢途径，即使在相同的环境体系和碳源供给条件下，土壤微生物群落在代谢流模式上也存在明显的组间差异。微生物代谢流评估模型与基因组学的手段形成有效的互补，将加深我们对环境微生物的动态和表观代谢的认识。
　　基因组学的调查表明土壤微生物的糖酵解途径（EMP）的比例更多（Edirisinghe et al., 2016 ），而微生物代谢流评估模型表明在群落水平上，环境微生物以戊糖磷酸途径（PP）为主，推测原因是PP途径是一种重要的还原性辅酶II途径，活跃的PP途径有助于微生物抵抗陆地的氧化胁迫。
　　另外，前人研究表明，相对于土壤微生物，海洋微生物的ED途径（由Nathan Entnert和Michael Doudoroff科学家发现，故此命名）在代谢途径中更加重要（Klingner et al., 2015 ），但微生物代谢流评估模型发现土壤微生物，尤其是革兰氏阴性细菌，ED途径具有较高的代谢途径占比（约40%）。
　　这种多样化的代谢流模式促成了微生物多样化的碳利用效率（0.31-0.65），对于理解微生物固碳具有重要的指导意义，比如通过代谢流的研究，可以筛选出碳利用率较高的微生物菌株，从而应用到环境微生物工程领域，以减少CO2的排放，为碳中和和碳达峰提供理论支持。
　　论文于2022年11月4日以＂In situ persity of metabolism and carbon use efficiency among soil bacteria＂为标题发表在著名期刊科学杂志的子刊Science Advances上。上海海洋大学海洋科学学院吴伟超研究员为论文的第一和通讯作者，研究得到中国自然基金委青年基金项目（42106046）、欧盟＂地平线2020＂计划玛丽居里项目（840240）和德国自然基金重点项目（DI 2136/17-1）的资助。
　　原文链接
　　https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abq3958
　　联系作者
　　吴伟超，上海海洋大学海洋科学学院
　　Email：wcwu@shou.edu
　　参考文献
　　Klingner, A., et al. (2015). ＂Large-Scale 13C Flux Profiling Reveals Conservation of the Entner-Doudoroff Pathway as a Glycolytic Strategy among Marine Bacteria That Use Glucose.＂  Applied and Environmental Microbiology  81(7): 2408-2422.
　　Edirisinghe, J. N., et al. (2016). ＂Modeling central metabolism and energy biosynthesis across microbial life.＂  BMC Genomics  17(1): 568.
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