植物中C1半胱氨酸蛋白酶的研究进展

　　蛋白酶几乎参与到所有的生物现象，它不仅仅是将蛋白质水解成氨基酸以便机体循环，还可以激活蛋白质或使蛋白质失活。不仅如此，蛋白酶已经成为现代食品和饲料工业生产中不可或缺的部分，为人类和动物的消费创造出庞大而多元化的产品。
　　从植物中提取的酶制剂已用于工业生产中很长一段时间，尽管关于酶的性质和特性还不清楚。很多商业用酶都来源与微生物，但是植物来源的酶因其在工业、生物工程和制药领域的应用而变得越来越重要。已有研究在菊科、木瓜科、桑科、萝藦科、夹竹桃科的乳液中分离出蛋白酶，这些蛋白酶大多属于C1半胱氨酸蛋白酶，因其在很宽的温度和pH范围内都有活性而得到了人们广泛关注，比如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶等被广泛应用于不同领域的工业和制药领域。
　　1 半胱氨酸蛋白酶的定义
　　半胱氨酸蛋白酶，也被称为硫醇蛋白酶，是生物体中蛋白水解酶的一大类。目前，国际上通用的蛋白酶分类方法是根据酶的活性中心组成来分类，半胱氨酸蛋白酶在其活性中心含有亲核Cys残基，同其他两个关键氨基酸组成了Cys-His-Asn/Glu的催化三联体催化相应的蛋白水解。
　　2 植物中半胱氨酸蛋白酶的分类
　　植物中的半胱氨酸蛋白酶主要分为木瓜蛋白酶(C1)家族或者豆类天冬氨酸蛋白内切酶(C13)家族两大类。其中木瓜蛋白酶家族是最大的家族，因为较广的底物选择性和热稳定性而被应用于很多领域，成为人们研究的热点。此外，也有研究发现还包括天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶亚家族(C14)、钙依赖半胱氨酸蛋白酶亚家族(C2)等。
　　3 植物中C1半胱氨酸蛋白酶的纯化和性质表征
　　19世纪40年代以来，已有多种半胱氨酸蛋白酶从灌藦、牛角瓜属、阿鲁藤属、猕猴桃属等植物中被分离鉴定。其中C1家族半胱氨酸蛋白酶的相关研究最多，比如木瓜蛋白酶、猕猴桃素、蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和菠萝蛋白酶，对这些蛋白酶进行酶学性质表征研究，对其在饮料、食品和制药领域具有十分重要的意义。
　　从番木瓜乳液中分离得到的木瓜蛋白酶是最先发现的C1半胱氨酸蛋白酶，该酶的分子量为23.4 kDa，最适pH 5.5 7.0，在中性pH和高温下稳定。其他几种木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶也逐渐被发现，Actinidin是从猕猴桃果实中提取的一种类似木瓜蛋白酶的水解酶，Carne和Moore曾经在中华猕猴桃果实中将其分离并且获得了该酶的氨基酸序列。张敏等在凉薯的种子中分离得到了蛋白酶SPE31，从木瓜属的多种植物中分离得到了木瓜蛋白酶，但是却表现出了不同的蛋白水解活性，凤梨属植物中也分离得到了多种该家族蛋白酶，在医学上被广泛用于驱虫药，并且具有良好的热稳定性，在65  条件有最适活性。在狗牙花属植物的乳液中发现了3种半胱氨酸蛋白酶，分别命名为Ervatamins A，B和C，这三种酶在结构和功能上都有很大的不同。研究发现Ervatamin-C最为稳定，在pH 2 12，温度70  ，高浓度化学变性剂存在的条件下仍能维持二级和三级结构保持活性。
　　4 植物中C1半胱氨酸蛋白酶的催化机理研究
　　木瓜蛋白酶家族中的很多蛋白的3D结构都已经被解析，包括木瓜蛋白酶、猕猴桃素、木瓜蛋白酶IV、组织蛋白酶B等。通过底物类似物抑制剂和酶晶体结构研究可证实该酶的底物特异性。尽管该家族酶的一级结构和三级结构具有很高的同源性，但是在稳定性、活性和底物特异性上有很大差别。
　　C1家族蛋白酶通常以酶原的形式存在，大多数为内切酶，少数为外切酶。含有10 26个氨基酸残基组成的前导肽，前导肽结合到内质网后，通过分子内或分子间蛋白水解而激活酶的活性区域。
　　木瓜蛋白酶是典型的C1半胱氨酸蛋白酶。木瓜蛋白酶是一条多肽链，其在空间折叠形成两个结构域，而在结构域间会形成一个内含有酶的活性位点的缝隙，催化三联体由Cys25-His159-Asn175组成。木瓜蛋白酶的催化机制其实就是酰基化和去酰基化的组合。即在His159作用下，Cys25去质子化，亲核性增强，而His159成为带正电荷的共轭酸。Asn175通过氢键帮助His159摆放咪唑环，使去质子化得以发生，然后Cys25亲核攻击主肽链上的羰基碳，并与之共价连接形成酰基-酶的中间体，进而水分子进入活性中心，在一个水分子的作用下，酶发生去酰基化，并释放肽链的羰基末端。
　　5 植物中C1半胱氨酸蛋白酶的分子生物学研究
　　多种C1家族的基因在pET 28a，pET 22a等原核表达系统中实现了异源表达，并对重组蛋白的分子量、酶学特征等进行分析。Michael T等在大肠杆菌中异源表达了来自萌芽的大豆种子中的半胱氨酸蛋白酶前体proEP-B2，重组蛋白的表达产物多为包涵体，表达量可达到50 mg/L，酶原在酸性条件下很快自激活成为成熟酶EP-B2。Sruti Dutta等使用pET28a (+)和 pET 39b(+)载体构建了ErvC前体的重组载体，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，重组酶跟天然酶相比，同样与底物的P2位点特异性结合，在热稳定性方面也相同，都可以在温度达到70  的时候保持75%以上的活力。
　　半胱氨酸蛋白酶参与植物器官的衰老过程，其中参与衰老细胞基因上调表达的基因SAGS大多属于C1家族。已有研究发现大麦中的HvSF、拟南芥中的SAG12，玉米中的See1，多花黑麦草中的See1，油菜中的BnSAG12-2，番茄的Cyp-3和烟草的NT CP-23等基因参与了植物叶的衰老过程。通过构建玉米cDNA文库发现了有两个不同的克隆编码玉米种子半胱氨酸蛋白酶的基因序列，分别命名为CCP1和CCP2各编码371个和360个氨基酸，CCP2与oryzain和aleurain在结构上表现出高度的结构上的相似性(同源性分别为87%和89%)。CCP1和CCP2编码的半胱氨酸蛋白酶在玉米种子的发芽与成熟过程中都扮演着不同的角色。
　　6 展望
　　因为植物来源的酶在安全性上要优于微生物来源，所以从植物中提取的酶制剂已被应用于工业生产中很长一段时间。C1半胱氨酸蛋白酶因为其在酶学特性上的优异表现而受到人们的广泛关注。同时，工业生产对酶制剂提出了越来越高的要求，因此通过分子生物学的方法改变C1半胱氨酸蛋白酶的催化活性、热稳定性及耐酸碱性等就显得尤为重要。因此，今后的研究重点将主要集中在一下几个方面：第一，开发新的植物来源的半胱氨酸蛋白酶，第二，对已知的蛋白酶进行进化改造，第三，构建安全可靠的异源表达载体以保证该酶的大规模生产，以保证工业生产的需求。