紫心甘薯多糖的分离及组分抑癌活性研究的论文

　　天然活性多糖是一类结构复杂的生物大分子物质，作为植物细胞壁的结构成分广泛存在于自然界中，具有机体免疫调节、抗氧化、降血糖血脂等作用近年来，多糖研究日益受到人们的关注。目前，实验室常用热水浸提和低温碱提两种方法来获得天然活性多糖，如香菇多糖,海藻多糖等M。已有研究表明，采用热水浸提所得的天然植物多糖（如人参多糖）经纯化在体内外均具有一定的抗肿瘤活性0,也有报道紫心甘薯水提粗多糖在体内有一定的抑瘤效果,但尚未见到关于紫心甘薯多糖分离及组分抑癌研究的相关报道。本研究结合浙江省临安市太阳镇紫心甘薯基地的开发课题，以紫心甘薯＂渝紫263＂为材料,通过低温碱提获得紫心甘薯粗多糖,研究紫心甘薯多糖组分的分离条件,并借助体外细胞实验和红外光谱等检测手段初步探究紫心甘薯多糖的结构成分及组分的抑癌作用，为进一步开发和利用紫心甘薯提供理论指导和实验依据。
　　1材料与方法
　　1.1材料
　　1.1.1实验材料与试剂紫心甘薯，由浙江省临安市太阳镇紫心甘薯实验基地提供;肿瘤细胞株Hela、HepG:,由浙江大学医学院提供；DEAE-Cellulose,华东医药试剂；CM-Cellulose,华东医药试剂；SephacrylS-t00,美国GE公司;D-葡萄糖醛酸，国药集团试剂；咔唑，中国远航试剂;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI1640培养基，Hyclone公司；MTT,Sigma公司（临用时用PBS配置成5mg/ml溶液，分装避光-20 C保存）；DMSO,Sigma公司；
　　标准单糖（葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖）、NaCl、苯酚、浓硫酸、甲苯胺蓝等试剂均为国产分析纯。
　　1.1.2主要仪器AKTAprimeplus层析系统，美国GE公司；LDR44.4C低速冷冻离心机，北京医用离心机厂；高速冷冻离心机,BECKMANCOULTER；可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；RE-2000旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂；电子天平，德国IKA;磁力搅拌器，IKARHbasicl;红外光谱仪470FT-IR,NEXUS公司；倒置显微镜，OLYMPUS；二氧化碳培养箱，美国FormaScientific公司；516MC酶标仪，国产;各种尺寸层析柱，上海华美实验仪器厂;薄层层析硅胶板,浙江台州；真空干燥装置,上海一恒科技有限公司；层析缸，国产。
　　1.2方法
　　1.2.1紫心甘薯多糖提取参见文献0。甘薯洗净、去皮、烘干后粉碎；用3倍体积95%乙醇于80C水浴中回流脱脂2h,重复一次，晾干后在70C水浴中水提2h,离心分离上清液,残渣重复操作一次;合并上清液，浓缩,三氯乙酸法除蛋白，用3倍体积85%乙醇沉淀多糖；无水乙醇、丙酮反复洗涤；将沉淀在低温下用10%NaOH以1:10的比例进行碱提，浓缩，蒸馏水透析48h;用3倍体积85%乙醇沉淀多糖；离心取沉淀，用无水乙醇反复洗涤；真空烘干后得PPSP粗多糖。
　　1.2.2多糖标准曲线绘制苯酚4硫酸法检测糖含量，以葡萄糖为标准单糖,绘制葡萄糖标准曲线;硫酸咔唑法检测糖醛酸含量，以葡萄糖醛酸为标准品,绘制糖醛酸含量测定标准曲线。1.2.3离子交换层析参见文献_。离子交换柱的选择：配置0.05mol/LPBS缓冲液（K2HPO4-CH2PO4),再用此缓冲液配置0.5mol/LNaCl溶液,用0.45^m纤维素微孔滤膜过滤，超声脱气30min。将处理好的DEAE~Cellulose和CM-Cellulose分别装柱（2.6X30cm),用3倍柱体积的缓冲液平衡。取PPSP粗多糖，用去离子水配置成5mg/ml的PPSP多糖溶液,分别上样10ml,待吸附30min后，用相同体积的去离子水分别洗脱,流速1ml/min,每管10ml收集,苯酚^硫酸法检测,记录并作洗脱曲线。
　　洗脱液pH的选择：选用上述吸附效果较好的柱子，取50mgPPSP粗多糖3份,分别溶于10ml的pH7.2、H7.6、H8.1和pH8.6的PBS缓冲液中，经0.45^m滤膜过滤，缓慢上样，吸附30min后，用200ml对应pH缓冲液洗脱，流速1.0ml/min,每管10ml,苯酚~硫酸法检测，记录并作洗脱曲线。
　　洗脱方式的选择：确定交换柱与pH缓冲体系之后，探究不同洗脱方式对PPSP洗脱效果的影响。取5mg/ml多糖溶液10ml,滤膜过滤,缓慢上样，吸附30min。先后分别用蒸馏水、0.05mol/LpH7.6的PBS缓冲液结合0.1、.3、.5mol/LNaCl分段洗脱。流速1.0ml/min,每管10ml,分别收集。苯酚~硫酸法测定,作洗脱曲线，合并主要峰，透析除盐，浓缩，冷冻烘干待用。
　　1.2.4多糖收集和检测利用美国GE公司蛋白纯化仪自动收集器收集离子交换层析的洗脱液,采用苯酚4硫酸法跟踪检测各PPSP多糖组分（od490),以管号为横坐标，吸光值为纵坐标绘制洗脱曲线，收集同种多糖组分。双蒸水透析48h,每12h换一次水,磁力搅拌。透析完毕,冷冻干燥得各多糖组分。
　　1.2.5凝胶过滤层析将处理好的SephcrylS400装柱（屮2.6X30cm),用0.05mol/L的NaCl平衡,流速0.5ml/min。上述分离得到的样品溶于0.05mol/L的NaCl溶液中，滤膜过滤后取5ml缓慢上样，用0.05mol/L的NaCl溶液150ml洗脱，流速0.5ml/min,每管5ml分部收集,苯酚4硫酸法检测,作洗脱曲线图。
　　1.2.6薄层层析样品处理:取紫心甘薯多糖样品，按多糖：硫酸=4:1的比例加入6mol/L的％SO4,密封90C水解6h,碳酸钡中和，离心去沉淀。取葡萄糖、糖醛酸、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖等标准单糖做同样处理。待硅胶板活化后，用毛细管进行点样。展层剂:正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：乙酸:水=7:20:12:7:5;显色剂:苯胺4卩苯二甲酸。
　　1.2.7红外光谱鉴定取约1mg已纯化的PPSP多糖组分样品，与适量KBr粉末在白炽灯下干燥磨混均匀，压片机压片，采用傅里叶变换红外光谱仪在4000cm-1~400cm-1区间扫描。
　　1.2.8MTT法检测PPSP多糖组分对Hela和HepG2肿瘤细胞的体外抑制作用参见文献。取对数生长期的Hela和HepG细胞，分别用胰蛋白酶消化后接种于96孔板中。设置不同PPSP多糖组分浓度的实验组，将标准葡萄糖和PPSPI、PPSPn、PPSPM三种多糖组分临用前用PBS配置成终浓度为10、20、40、80^g/ml溶液,紫外灭菌。每个实验组的各浓度梯度组,每孔加上述多糖组分溶液20空白对照组加入相同体积的PBS,每组设4个复孔，置于37C,5%CO2培养箱培养。在加样后第24、8、96h时各取一块96孔板，加入20^lMTT溶液继续培养4h。小心吸尽培养液，加入200^lDMSO,震荡,使蓝紫色结晶物充分溶解,于490nm波长下测各孔吸光度。肿瘤细胞抑制率公式:抑制率IR(%)=(1-A实验组/A空白对照组）x100%。
　　1.3数据处理采用SPSS18.0进行数据处理和分析,实验数据取三次平均值,采用方差分析（F检验）,有显著差异时，再作共同对照t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果与分析
　　2.1多糖提取及标准曲线经碱提法获得紫心甘薯粗多糖,经计算其得率为31.72%;检测到样品中糖含量为55.4pg/ml,糖醛酸含量为
　　11.51^g/ml；实验得出葡萄糖标准曲线为：A=0.5C-0.005(R=0.9986),糖醛酸标准曲线为：A=0.0053C(R2=0.9991)。
　　2.2离子交换层析
　　不同类型弱离子交换柱选择在一定条件下，分别经DEAE-Cellulose弱阴离子交换柱和CM-Cellulose弱阳离子柱父换洗脱，洗脱图见图1。图1(a)的洗脱峰基本对称,峰形较规则;相比之下，图1(b)的洗脱峰较宽，无对称性且分布不均匀。推测DEAE-Cellulose柱对PPSP多糖的选择吸附性要比CM-Cellulose柱好，因此本实验选用DEAE-Cellulose柱分离PPSP多糖。2.2不同pH缓冲液选择PPSP多糖经不同pH值的PBS缓冲液洗脱得洗脱图，见图2。多糖是一类多羟基聚合物，中性或酸性多糖容易在碱性条件下被弱阴离子交换柱吸附。从图
　　2(a)分析可知,pH7.2的缓冲液洗脱时并没有出现对称峰形,继续洗脱得到拖尾峰。图2(b)显示,pH7.6的＂缓冲液在洗脱体积为100ml时开始出峰,且峰形对称、均一、含量较大。结合图2(c)和图2(d)分析,洗脱液碱性条件(pH大于8.2)对PPSP多糖分离不利，因此PPSP多糖分离的最佳洗脱缓冲液pH值为7.6。
　　2.2.3洗脱方式优化在pH7.6的条件下,将PBS缓冲液结合NaCl溶液进行0~1mol/ml浓度范围的线性洗脱（图3)。可以看出，第一个PPSP多糖组分分离完全,但继续洗脱后并没有将剩余多糖组分很好地分离。推测线性洗脱时低盐浓度对PPSP的分离有效，高浓度盐溶液不适用于该多糖的分离。
　　与线性梯度洗脱相比较，分段洗脱更适用于不同多糖组分间的分离，峰形陡而尖且相对
　　完整,见图3。收集四个多糖组分吸收峰，分别命名为ppspI、ppspn、ppspm和ppspw。前三个多糖组分的含量相对较高，经过SephcrylS-400凝胶柱后得到了单一对称峰,纯度较好。
　　根据以上实验结果，本实验选用以下条件来进行PPSP多糖的离子交换色谱分离：弱阴离子交换柱DEAE-Cellulose；在pH7.6的0.05mol/LPBS缓冲液（I(2HPO44CH2PO4)体系下,采用200mlPBS缓冲液、200ml0.1mol/LNaCl溶液、300ml0.3mol/LNaCl溶液和100ml0.5mol/LNaCl溶液进行分段洗脱。
　　1.3薄层层析结果完全酸水解的紫心甘薯多糖PPSPI、PPSPH、PPSP1,二次层析结果分析多糖组分的单糖组成为:PPSPI主要由葡萄糖和半乳糖组成，ppspn主要由葡萄糖组成;ppspm没有检测到结果，分析可能与其糖蛋白成分干扰有关。
　　2.4红外光谱结构分析ppsph的红外光谱图（图4):881cm-1的峰表明PPSPH中的糖苷键为P型（a型糖苷键的吸收峰在890cm-1左
　　右处）。1097cm-1和1041cm-1的吸收峰表在1384~1076cm-1具有明显特征吸收峰），示PPSPH中的糖环构型为吡喃型（呋喃型糖环表明PPSPH具有P~D-葡萄吡喃聚糖的特征吸收峰。
　　PPSP1的红外光谱图（图5)：在3422cm-1附近有O-H伸缩振动的强吸收峰，1630cm-1可能是~CHO中C=O的伸缩振动,这两组峰是多糖的特征吸收峰;1100cm-1可能是C4的弯曲振动峰,另外,在1425cm-1具有较弱的吸收峰，为蛋白质特征吸收峰。因此，推测ppspm可能为糖蛋白。
　　1.5多糖组分对肿瘤细胞株Hela和HepG:的体外抑制作用PPSPn组分对Hela和HepG2肿瘤细胞株的体外抑制效果如图6所示,PPSPH对Hela和HepG:细胞在体外具有一定的抑制作用，并呈剂量依赖效应。从图6(a)中可看出，10ag/ml剂量组在48h时达到最大,然后
　　开始下降,20ag/ml和40ag/ml剂量组在24h时达到最大,80ag/ml剂量组受到强烈抑制,细胞数量一直下降。从图6(b)图中可以看出,PPSPn组分
　　41.83%,61.45%,68.67%(P<0.01)。图6(c)中显示，不同浓度的ppspn组分作用下,20ag/ml,40ag/ml,80ag/ml剂量组均在48h时细胞活力达到最大，然后开始下降。从图6(d)中可看出，PPSPH组分对HepG2细胞株在96h时均有较高的抑制率,分别为30.76%,36.83%,42.46%,48.53%(P<0.01)。
　　PPSP1组分对Hela和HepG2肿瘤细胞株的体外抑制效果如图7所示,PPSP1对Hela和HepG2细胞在体外具有一定的抑制作用，并呈剂量依赖效应。从图7(a)中可看出,20ag/ml和40ag/ml剂
　　量组在48h时细胞活力达到最大,80ag/ml剂量组在24h时细胞活力达到最大,然后开始下降。从图7(b)中可以看出,40ag/ml剂量组在48h和96h的抑制率分别为34.50%和42.07%(P<0.05),80ag/ml剂量组在48h和96h时的抑制率分别为42.81%(P<0.05)和54.13%(P<0.01)。从图7(c)中显示，20ag/ml'40ag/ml'80ag/ml剂量组均在48h时细胞活力达到最大,然后开始下降。从图7(d)中可得,40ag/ml剂量组在96h时抑制率为54.68%(P<0.05),80ag/ml剂量组在24h、48h和96h时抑制率分别为33.15%(P<0.05),41.86%(P<0.05)和71.08%(P<0.01)。
　　同时,本实验在设计了PBS溶液作为空白对照组以外，还选取标准葡萄糖溶液作为实验参考。实验发现:加入标准葡萄糖溶液后，Hela和HepGi肿瘤细胞的生长趋势与空白对照组相似,且相应同浓度的标准葡萄糖对两种肿瘤细胞的抑制不明显，不存在剂量依赖效应。
　　3讨论
　　本实验以浙江省临安市太阳镇紫心甘薯＂渝紫263＂为研究对象,低温碱提法获得紫心甘薯多糖，在比较了ppsp多糖的弱阳离子和弱阴离子交换柱的洗脱分离效果后，选用DEAE-Cellulose弱阴离子交换柱进行分离，获得了4个多糖组分（PPSPI、PPSPn、PPSPM和PPSP^)。据国外研究报道13,中性多糖和酸性多糖常通过弱阴离子交换柱进行分离,低盐浓度下洗脱得到中性多糖，而高盐浓度下洗脱的多为酸性多糖；中性多糖可以进一步经凝胶过滤层析被分离成a-葡聚糖（吸附较强）和p肩聚糖（吸附较弱）。本实验中发现,ppspI在低盐浓度下最先被洗脱出来，且经检测不含糖醛酸,推测PPSPI为中性多糖组分,PPSPH、PPSPM和PPSPW随后被洗脱分离，推测为酸性多糖。紫心甘薯多糖组分的体外抑癌实验结果表明，酸性多糖PPSPH和PPSPM在体外对Hela和HepGi肿瘤细胞株生长有一定的抑制作用，而中性多糖PPSPI无明显的抑制效果。以上结果与文献报道的天然活性多糖中酸性多糖对癌细胞生长有较明显抑制效果的观点相符M。
　　多糖组分的结构与其生物活性之间的关系一直是研宄的热点和难点。天然活性多糖中含有丰富的中性多糖和酸性多糖，单糖间以糖苷键相连,有些单糖与蛋白质或脂质相连,构成糖蛋白或糖脂，这些不同的连接方式赋予了天然活性多糖抗肿瘤活性的良好结构基础&443。本实验从PPSP多糖对肿瘤细胞体外抑制实验结果中初步表明＂渝紫263＂中所含的天然活性多糖中的PPSPH和PPSPM组分具有一定的体外抑癌活性，分析可能与它所含有的P~D-葡萄吡喃聚糖和糖蛋白成分有关。目前PPSPH、PPSPM组分的构效分析仍在深入研究中。