锌依赖的金属蛋白酶1对巨噬细胞凋亡的促进作用论文

　　结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的以呼吸道病变为主的一种慢性的传染病。据世界卫生组织最新统计，仅2013年约900万例新发结核病病例，约150万人死亡。卡介苗(BacillusCalmetteGuerinvaccine，BCG)是使用最广泛、最安全的预防结核病的唯一疫苗，但它在不同地区和接种人群中免疫效果不稳定，为0% 80%不等，其具体的机制不明。锌依赖的金属蛋白酶1(zinc-dependentmetalloprotease1，Zmp1)是MTB的一种毒力因子。Zmp1与MTB的致病关系密切，可影响吞噬体与溶酶体的融合而使MTB逃避免疫清除。巨噬细胞是MTB感染与免疫形成的关键细胞，巨噬细胞的凋亡在机体抵抗病原菌的感染有重要作用。BCG中的Zmp1对巨噬细胞的增殖凋亡有无影响目前尚无相关文献报道。本研究旨在构建BCG的zmp1基因含增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的真核表达质粒pEGFPN1-zmp1，并转染RAW264.7巨噬细胞，观察zmp1基因表达产物对巨噬细胞凋亡的影响。为进一步明确Zmp1对巨噬细胞的作用、Zmp1对免疫功能的影响奠定基础。
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　pEGFP-N1质粒、Top10菌株、BCG菌株(丹麦株)均由重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心实验室保存;RAW264.7细胞由重庆医科大学生命科学研究院惠赠;500bpDNAladder购自北京天根生化科技有限公司;限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ均购自大连宝生物工程有限公司;1 高糖DMEM、2.5g/L胰蛋白酶溶液、胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)均购自Hyclone公司、LipofectamineTM2000Reagent均购自Invitrogen公司。藻红蛋白标记的膜联素Ⅴ/7-氨基放线菌素D(annexinⅤ-phycoerythrin/7-amino-actinomycin，annexinⅤ-PE/7-AAD)双染色试剂盒购自上海前尘生物科技有限公司。
　　1.2方法
　　1.2.1引物设计及合成根据GenBank登录的zmp1基因序列(NP_214712.1)，以真核表达质粒pEGFP-N1为框架设计2条zmp1基因PCR扩增引物并添加酶切位点，上、下游引物序列分别如下(酶切位点为波浪线部分):P1:5'-AAACTCGAGGCCACCATGGTGACACTTGCCATCCCC-3';P2:5'-AAAGGATCCGTTCCAGATCCGG-3';P1设计限制性内切酶XhoⅠ酶切位点，同时引入Kozak序列(划线部分)和起始密码子(ATG);P2设计限制性内切酶BamHⅠ酶切位点，同时删除zmp1基因C端的终止密码子，引物交由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
　　1.2.2构建真核表达质粒pEGFP-N1-zmp1BCG菌全基因组DNA为模板，PCR法扩增zmp1基因片段，反应体系50μL:5 高保真酶缓冲液10μL，高保真酶1μL，BCG菌全基因组DNA1μL，dNTP混合物4μL，引物P1和P2各1μL，灭菌双蒸水32μL。反应条件:95 预变性10min，(95 变性30s、55 退火30s、72 延伸2min) 32个循环;72 延伸10min;反应产物16 降温5min。经10g/L琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，按照试剂盒说明书进行回收纯化大小约2000bp的特异性PCR产物。PCR产物和pEGFP-N1质粒经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切，回收纯化zmp1片段和质粒片段;连接质粒片段与zmp1基因片段连接反应体系(20.0μL):10 T4缓冲液2.0μL、T4DNA连接酶1.0μL、pEGFP-N1质粒片段1.0μL、zmp1基因双酶切产物10.0μL、灭菌双蒸水6.0μL、4 连接12h。将连接产物转入E.coliTop10感受态细胞中，用LB(含卡那霉素20μg/mL)平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落接种到5mLLB(含卡那霉素20μg/mL)液体培养基中，37 培养12 14h，提取质粒。
　　1.2.3重组质粒鉴定菌落PCR法筛选鉴定阳性克隆，以挑单菌落的菌液为模板克隆zmp1基因;10g/L琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，分析结果。提取阳性克隆菌质粒酶切鉴定，经XhoⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定，酶切反应产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳分析结果。对双酶切鉴定正确的重组质粒进行核酸DNA双向测序鉴定。
　　1.2.4重组质粒在RAW264.7细胞中表达将核酸测序正确的重组质粒用脂质体LipofectamineTM2000转染RAW264.7细胞，37 恒温50mL/LCO2静置培养，同时以pEGFP-N1质粒转染RAW264.7细胞作为对照组。转染后24h，荧光倒置显微镜观察荧光表达。
　　1.2.5实时荧光定量PCR检测zmp1mRNA表达水平质粒pEGFP-N1-zmp1转染RAW264.7细胞48h后，根据RNA提取试剂盒说明书提取RAW264.7细胞总RNA;按照TaKaRaPrimeScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesisKit说明书逆转录合成cDNA。实时荧光定量PCR扩增zmp1基因上、下游引物(P3、P4)和β-actin上、下游引物(P5、P6)。P3为5'-ACGGGGGCGAGAGCCGTGAC-3'，P4为5'-CCAGTCTTCAACGTTAACGC-3';P5为5'-AACTCCATCATGAAGTGTGAC-3'，P6为5'-TAACGCAACTAAGTCATAGTC-3'。实时荧光定量PCR反应体系(15.0μL):SYBRK7.5μL、P3/P50.3μL、P4/P60.3μL、cDNA3.0μL、灭菌双蒸水6.6μL;95 5min、95 10s、60 15s、72 20s，循环39次;72 延伸6min。
　　1.2.6流式细胞术检测Zmp1蛋白对巨噬细胞凋亡影响实验分为3组，空白组(未转染质粒组)、转染pEGFP-N1质粒组(空质粒对照组)、转染pEGFP-N1-zmp1质粒组(实验组);转染后48h，用不含EDTA的2.5g/L胰蛋白酶消化收集细胞，室温下1500r/min离心5min，弃上清;适量PBS洗涤细胞2 3次;以1 结合缓冲液调整细胞数为1 106个/mL;取100μL细胞悬液于5mL流式管中，加入5μLannexinⅤ-PE和10μL7-AAD，轻轻混匀;避光、室温反应15min;加入400μL1 结合缓冲液，混匀，流式细胞术检测，每组实验分别独立重复3次。
　　2结果
　　2.1zmp1基因片段的扩增和鉴定
　　分别以BCG基因组和重组质粒为模板，PCR扩增zmp1基因片段，PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳分析，在2000bp左右出现特异性条带，条带大小与预期值相同。重组质粒pEGFP-N1-zmp1经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后，产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳分离，分别得到大小约4700bp和2000bp的条带。重组质粒DNA测序结果与GenBank登录的MTB中zmp1(NP_214712.1)基因序列比对显示完全相同，提示zmp1成功插入pEGFP-N1质粒中。
　　2.2zmp1mRNA在巨噬细胞中的表达和鉴定
　　转染后48h，提取细胞总RNA并通过逆转录反应合成cDNA，以cDNA作为模板和β-actin作为内参检测zmp1的表达。结果显示，仅pEGFP-N1-zmp1转染组检测到zmp1mRNA表达，pEGFP-N1转染组和空白对照组(未转染)均未检测到zmp1mRNA表达。
　　2.3各组RAW264.7细胞凋亡检测
　　流式细胞术检测细胞凋亡数据分析显示，转染后48h，实验组与空白组和对照组比较，早期凋亡率和坏死率有所增高，存活率有所下降，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　3讨论
　　巨噬细胞既是分枝杆菌感染的宿主细胞，又是一种抗感染的免疫细胞，它的`正常功能状态直接影响到分枝杆菌在细胞内的转归和结局。巨噬细胞凋亡在分枝杆菌感染的过程中是一种常发事件，现有的研究发现，分枝杆菌的多种分子可通过调节巨噬细胞的凋亡影响巨噬细胞的功能。一般认为，分枝杆菌感染后，诱导巨噬细胞的凋亡，通过形成凋亡小体，被活化的吞噬细胞吞噬消化有利于分枝杆菌的清除，这对于菌体抵抗分枝杆菌的感染有着重要作用。而有些致病力比较强的分枝杆菌，如MTB则通过它表达的分子抑制巨噬细胞凋亡过程，达到逃避免疫杀伤、潜伏的目的。相反，毒力弱的分枝杆菌如H37Ra、BCG等则常常促进巨噬细胞的凋亡。
　　Zmp1由MTB的Rv0198c基因编码，它是分枝杆菌的重要毒力分子，删除zmp1基因的BCG对动物的免疫保护性增强。它可通过抑制caspase-1激活，抑制炎性复合体激活和炎性趋化因子白细胞介素1β(interleukin1β，IL-1β)分泌，阻止吞噬体活化成熟，进而阻止吞噬溶酶体的结合和融合，影响后续的杀菌过程及特异性抗MTB免疫的激发。但它对巨噬细胞的增殖、凋亡的影响，尤其是巨噬细胞凋亡的影响还未见相关的报道。
　　因此，本实验设计重组的Zmp1胞内表达来观察该分子是否对巨噬细胞的凋亡是否产生影响，以利于后续的功能研究。实验中我们选用的RAW264.7巨噬细胞，生长旺盛能连续稳定分裂增殖，是研究巨噬细功能的常用细胞株。同时构建的质粒会表达绿色荧光蛋白，有利于我们的对蛋白表达的观察。流式细胞术是检测细胞凋亡的常用方法，我们采用annexinⅤ-PE和7-AAD来标记Zmp1作用的巨噬细胞，通过流式细胞术来检测细胞凋亡可了解Zmp1蛋白对细胞凋亡的影响。结果显示，重组蛋白Zmp1胞内表达可引起巨噬细胞早期凋亡率增高，这与Aguiló等的研究结论类似。本研究的结果为进一步研究Zmp1蛋白通过何种机制导致巨噬细胞凋亡，对巨噬细胞的免疫功能产生何种影响的研究奠定了基础。