辣椒素对非小细胞肺癌侵袭能力影响及其机制讨论

　　近年来，关于辣椒素( capsaicin，CAP) 抗癌作用的研究在国内外日益受到学者的高度重视。辣椒素是红辣椒中的一种活性成分。最近有研究表明，辣椒素可以抑制癌症细胞的增殖，促进凋亡，因此可以作为一种药物或传统化疗药物的辅助用药。目前恶性肿瘤占全球死因的第1 位，而肺癌是癌症相关死亡的首要原因，5年生存率15%。据预测，到2020 年，中国将有550 万新发肺癌病例，死亡人数将达400 万。在肺癌的病理学分型中，80% 为非小细胞肺癌( non-small cell lung cancer，NSCLC) ，包括腺癌、鳞状上皮细胞癌和大细胞癌，其侵袭和转移能力是导致患者死亡及复发的主要原因，并使其成为作为当今世界上对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一，给患者和家属及其社会带来极大的经济负担。虽然辣椒素具有抗癌症作用，但是其有关于NSCLC 的研究鲜见报导。本研究采用人大细胞肺癌NCI-H460 细胞，旨在观察辣椒素对NCIH460细胞侵袭能力及E 钙黏蛋白( E-cadherin) ，Slug 蛋白表达的影响，为明确辣椒素治疗恶性肿瘤提供实验依据，探讨其可能作用机制，以期为NSCLC 治疗提供新思路。
　　1 材料
　　1. 1 细胞人大细胞肺癌细胞NCI-H460，购自中科院上海细胞库。
　　1. 2 药物及试剂辣椒素( 纯度 99%) ，MTT，罗丹明标记的鬼笔环肽( 美国Sigma 公司，批号分别为100081-201408，M2128，PHDR1) ，Transwell 小室( 美国Corning 公司，批号3140908 ) ，E-cadherin 蛋白，Slug 蛋白，-actin( 上海浩然生物技术有限公司，批号分别为著名ZM0092，ZM2356，1208) ，E-cadherin鼠抗人单克隆抗体( 美国Pro Mab 公司，批号70796267A2) ，Slug 兔抗人多克隆抗体( 美国SantaCruz 公司，批号B2206) ，HRP 标记抗鼠IgG 二抗及HRP 标记抗兔IgG 二抗( 上海碧云天公司，批号BSE-0140G，BSE-0520G) ，逆转录试剂盒( 日本Promega 公司，批号9035-81-8) ，Quant SYBR GreenPCR 试剂盒( 美国TaKaRa 公司，批号BS-PCR003) 。
　　1. 3 仪器DFC 450C 型倒置显微镜( 德国莱卡公司) ，ABI-7300 型PCR 仪( 美国ABI 公司) 。
　　2 方法
　　2. 1 细胞培养NCI-H460 细胞保存在含有10%BSA 的RPMI-1640 营养培养基( 含L-谷氨酰胺，青霉素100 UmL - 1 和链霉素100 UmL - 1 ) ，37  ，5%CO2及饱和湿度下培养。当NCI-H460 细胞达80%汇合度时，用0. 05%胰蛋白酶/0. 02% EDTA 消化。按照细胞密度2 106 个/孔接种于超低吸附6孔板中， 37  ，5 %CO2及饱和湿度下培养48 h。收集悬浮的细胞经EDTA 处理制备成单细胞悬液，然后用RPMI-1640 培养液洗涤细胞。收集对数生长期细胞，备用。
　　2. 2 药物配置辣椒素溶解于DMSO，配成500 mmolL - 1溶液，- 20   保存。临用时，以完全培养液将辣椒素稀释到所需浓度。
　　2. 3 MTT 比色分析法测定细胞抑制率取对数生长期NCI-H460 细胞，按照细胞密度1 104 个/孔接种于96 孔板中，总体积为200 L，过夜培养。次日，实验组每孔加入终浓度为0， 100， 200， 300，400，500 molL - 1的辣椒素，空白组除未加辣椒素外，其余条件与实验组完全一致。每组设6 个平行孔，将培养板置于37   5% CO2及饱和湿度下培养，分别培养24， 48 h 后，每孔加入MTT 溶液( 5 gL - 1 ) 20L， 37  ，继续培养4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，然后每孔加入DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，570 nm 波长处，以空白培养液调零点，酶标仪测定吸光度A，取6 孔平均值。在graphpad prism 5 统计软件中计算出半数抑制浓度( IC50) 。抑制率= ( A实验组- A空白组) /( A空白组- A对照组) 100%。
　　2. 4 微丝荧光染色观察根据江隆昌和欧阳理权等方法，取对数生长期NCI-H460 细胞，按照细胞密度2 103 个细胞/接种于96 孔板中，实验组每孔加入终浓度为100， 200， 300 molL - 1 的辣椒素各10L，空白组除未加辣椒素外，其余条件与实验组完全一致。每组设6 个平行孔。PBS 洗涤2 次，再用4%多聚甲醛溶液于37  固定10 min; 然后，用含0. 1%TritonX-100 的PBS 洗涤细胞3 次，每次4 min。用含0. 2%BSA 的PBS 封闭30 min。随后，将细胞与1  100罗丹明标记的鬼笔环肽PBS 孵育15 min，PBS 洗涤3次。Olympus IX51 型荧光显微镜496 nm 处，观察细胞微丝的形态学变化。实验重复3 次。
　　2. 5 Transwell 小室体外侵袭实验根据史立宏等方法，Transwell 小室用前铺上0. 5% Matrigel膜基质50 L 于37  孵育过夜4 h。取对数生长期NCI-H460 细胞，将实验组细胞用终浓度为100，200，300 molL - 1 的辣椒素， 37   5% CO2及饱和湿度下培养24 h，空白组除未加辣椒素外，其余条件与实验组完全一致。按照5 104 个细胞接种于Transwell 小室内室，并在Transwell 小室下室加入含有10% BSA 的完全培养液。孵育24 h 后，取出Transwell 小室去除未穿膜细胞。甲醇固定15 min 后，再以10 gL - 1 Hoechst33342 染色30 min。OlympusIX51 荧光显微镜计数穿过微孔膜的细胞数。每组细胞随机计数10 个视野，取其平均值。实验重复3 次。
　　2. 6 Western blot 分析取对数生长期NCI-H460 细胞，将实验组细胞用终浓度为100， 200， 300 molL - 1的辣椒素， 37   5%CO2及饱和湿度下培养24 h，空白组除未加辣椒素外，其余条件与实验组完全一致。用细胞裂解液( 20 mmolL - 1 Tris-HCl， 1. 5%Triton X-100，150 mmolL - 1 NaCl，10% 甘油，1 mmolL - 1Na4P2O7，50 mmolL - 1 NaF，1 mmolL - 1 PMSF) 和蛋白酶抑制剂( 5 molL - 1 AEBSF-HCl，5 molL - 1EDTA，10 mmolL - 1 leupeptin，1. 5 mmolL - 1 E-64，pH 7. 4) 裂解细胞后，收集裂解液，Bradford 法测定蛋白质含量。取20 g 蛋白质加入等体积2 上样缓冲液，95   变性5 min。随后进行7. 5% SDSPAGE凝胶电泳。电泳后，电转至0. 45 m 硝酸纤维素膜，用含5% 的脱脂奶粉PBST( 25 mmolL - 1Tris pH 7. 5， 150 mmolL - 1 NaCl，0. 1% Tween20) 封闭1 h，分别加入E-cadherin 抗体，Slug 抗体( 1  1 000稀释) 4  孵育过夜，PBST 洗涤3 次，每次5 min。加入HRP 标记的二抗( 1  2 000 稀释) 室温孵育2 h，PBST 洗涤3 次，每次5 min。按同样的方法与-actin 抗体孵育。ECL 化学发光试剂显色，通过Bio-Rad 凝胶成像进行目的条带的表达检测及分析。蛋白的相对表达强度= 目标蛋白表达强度/-actin蛋白表达强度。
　　2. 7 Real-Time PCR( RT-PCR) 分析取对数生长期NCI-H460 细胞，将实验组细胞用终浓度为100，200， 300 molL - 1 的辣椒素， 37   5% CO2及饱和湿度下培养24 h，空白组除未加辣椒素外，其余条件与实验组完全一致。按照TRIzol 试剂盒说明书抽提总RNA。Nanodrop2000 检测RNA 纯度。使用MMLV逆转录试剂盒进行逆转录反应，成单链的cDNA，操作按照试剂盒说明书进行。利用Pubmed查找相关基因序列，并利用引物合成软件PrimerPremier 5. 0 设计引物，引物序列见表1。使用QuantSYBR Green PCR 试剂盒按照PCR 引物进行扩增，用Applied Biosystems 7500 型定量PCR 仪测出Ct值及熔解曲线，计算出相对基因表达量。每份样品检测3 次。
　　2. 8 统计学分析采用SPSS 17. 0 软件进行数据分析，计量数据用珋x s 表示，正态资料组间比较采用t 检验，多样本均数采用单因素方差分析，以P 0. 05 为差异有统计学意义。
　　3 结果
　　3. 1 对NCI-H460 细胞增殖的影响不同终浓度( 100   500 molL - 1 ) 的辣椒素分别作用于NCIH460细胞24，48 h 后，随着终浓度的增大和作用时间的延长，其对细胞的抑制率也明显增强，呈浓度和时间依赖性，与空白组比较，差异具有统计学意义( P 0. 05) 。辣椒素24， 48 h 的IC50分别为366. 2，328. 2 molL - 1。
　　3. 2 对NCI-H460 细胞丝状伪足形成的影响微丝荧光染色后发现，辣椒素终浓度为100 molL - 1时，NCI-H460 细胞有明显的丝状伪足形成，表现为细胞表面形成微丝突起并且延伸到细胞外，而且充满与相邻的其他肿瘤细胞相接触的平行排列肌丝纤维。辣椒素终浓度为200， 300 molL - 1 时，NCI-H460 细胞未见明显丝状伪足形成，可有效抑制丝状伪足的伸出，仅见细胞表面可见少量突起，肌动蛋白丝网状排列。
　　3. 3 对NCI-H460 细胞体外侵袭能力的影响辣椒素终浓度为200，300 molL - 1时，NCI-H460 细胞侵袭细胞数均显著下降，并呈浓度依赖性，与空白组比较，差异具有统计学意义( P 0. 05) 。辣椒素终浓度为100 molL - 1时，NCI-H460 细胞侵袭细胞数虽然减少，但是与空白组比较，差异无统计学意义。
　　3. 4 对NCI-H460 细胞E-cadherin，Slug 蛋白表达的影响辣椒素终浓度为200， 300 molL - 1 时，显著升高E-cadherin 表达水平，并呈浓度依赖性，与空白组比较，差异具有统计学意义( P 0. 05) 。辣椒素终浓度为200， 300 molL - 1 时，显著降低Slug 表达水平，并呈浓度依赖性，与空白组比较，差异具有统计学意义( P 0. 05，P 0. 01) 。辣椒素终浓度为100 molL - 1 时，E-cadherin 和Slug 表达水平与空白组比较，差异无统计学意义。
　　3. 5 对NCI-H460 细胞E-cadherin，Slug mRNA 表达的影响辣椒素终浓度为200， 300 molL - 1 时，显著升高E-cadherin mRNA 表达水平，并呈浓度依赖性，与空白组比较，差异具有统计学意义( P 0. 05) 。辣椒素终浓度为200，300 molL - 1 时，显著降低Slug mRNA 表达水平，并呈浓度依赖性，与空白组比较，差异具有统计学意义( P 0. 05，P 0. 01 ) 。辣椒素终浓度为100 molL - 1 时，Ecadherin和Slug mRNA 表达水平与空白组比较，差异无统计学意义。
　　4 讨论
　　肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，其中80%为NSCLC，只有20%   30% 的患者有手术机会，但是即使是在手术切除的早期NSCLC 患者中，也有2 /3 的患者存在复发和转移的危险，侵袭转移是患者死亡和治疗效果不理想的主要原因。目前对于放疗、化疗等主要治疗肺癌的手段已经进入平台期，然而其分子机制尚不明了，因此探讨肺癌分子水平侵袭转移机制尤为必要。
　　近年来，传统中药应用于抗癌症的治疗成为研究抗癌药物的新的热点，受到广大医药学工作者的广泛重视。辣椒素( 结构为反式8-甲基-N-香草基-丁-壬烯胺) 是红辣椒中的一种活性成分，作为食物和传统药物已有几千年的历史，于1999 年载入《美国药典》。辣椒素可通过多种途径在体内外发挥抗癌症作用，如刘南等研究表明，辣椒素可抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤得生长。另外还有报道称，辣椒素可诱导人黑色素瘤A375-S2 细胞的凋亡。然而辣椒素对NSCLC 是否具有抑制作用目前尚不明了。故此，本研究以不同终浓度辣椒素作用于NCI-H460 细胞，观察辣椒素的抗NSCLC 效应。结果发现辣椒素对NCI-H460 细胞细胞活率有一定抑制作用，提示辣椒素具有潜在的抗NSCLC 效应。E-cadherin 是一类主要介导细胞之间相互黏附的钙依赖性跨膜蛋白，主要表达在上皮细胞，广泛参与细胞间的连接，对于维持正常上皮细胞的完整性十分重要。E-cadherin 结构和功能异常可致癌细胞间黏附松散，癌细胞极易从原发部位脱落，并沿淋巴管，血管外膜及组织间隙浸润蔓延，破坏邻近正常组织并继续生长，形成转移癌。Slug 基因是Snail超家族成员之一，能识别E-cadherin 基因启动子上E2-box 元件以抑制靶基因E-cadherin 的转录，下调E-cadherin 蛋白表达，共同促进癌症细胞的原位侵袭和远处转移。赵志娟等研究表明，Slug 基因的过表达同时伴有E-cadherin 的低表达或缺失与诱发胰腺癌、骨肉瘤、结直肠癌、口腔鳞癌等肿瘤的发生、发展和转移高度相关。本研究中，以辣椒素处理NCI-H460 细胞，微丝荧光染色和Transwell 小室体外侵袭实验结果显示，辣椒素可显著抑制丝状伪足形成和侵袭细胞数，证明辣椒素可抑制癌症细胞的侵袭。进一步通过Western blot 和RT-PCR 分析结果显示，辣椒素可减少NCI-H460 细胞Slug 蛋白和mRNA 表达，增加E-cadherin 蛋白和mRNA 的表达，揭示辣椒素可能通过抑制Slug 表达而增加Ecadherin表达来抑制癌症的远处侵袭能力。本研究结果与赵志娟等研究结果高度类似，故此可以推测，抑制Slug 表达和增加E-cadherin 表达可抑制NSCLC 侵袭。
　　综上所述，辣椒素具有明显的NCI-H460 细胞毒性作用，可降低NCI-H460 细胞活率。而且辣椒素可通过降低Slug 表达，增加E-cadherin 表达抑制NCI-H460 细胞侵袭能力，可能是其抗NSCLC 的机制之一，为NSCLC 治疗提供新的思路。