谈姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF表达的影响

　　姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种天然有效成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种药理作用，且毒性低，具有良好的临床应用潜力，尤其是其抗肿瘤作用受到国内外广泛关注。结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，虽然近年来以手术、化疗、放疗、免疫等的综合治疗手段取得了一定的进展，但其死亡率仍居高不下，毒性作用依然限制着化疗药物和免疫制剂等的应用和疗效。有研究表明，姜黄素能显著抑制结肠癌HCT-116 细胞的生长，姜黄素能显著抑制人结肠癌Lovo 细胞的增殖并促进其凋亡，研究证实在肿瘤的侵袭、转移过程中，血管内皮生长因子(VEGF)起到了极其重要的作用。该实验以2013 年8 月2014 年2 月中南大学提供的结肠癌Lovo 细胞作为研究对象， 观察了不同浓度姜黄素对结肠癌Lovo 细胞VEGF表达的影响， 以求从多角度对姜黄素对结肠癌细胞的作用进行研究，对结肠癌临床治疗提供有益的理论依据，现报道如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　人结肠癌Lovo 细胞由中南大学肿瘤研究所提供; 姜黄素购自Sigma 公司， 称取3.684 mg 的原料药充分溶解于1 mL DMSO中，得到终浓度为10 mmol/L 的母液，临用时用完全细胞培养液稀释到所需浓度。Trizol、逆转录试剂盒购自大连宝生物公司， 引物由大连宝生物公司合成。蛋白提取液及ECL 发光试剂盒购自Pierce 公司， 兔抗人VEGF 多克隆抗体及羊抗兔二抗lgG 购自Santa Cruz 公司。
　　1.2 细胞的培养及处理
　　人结肠癌Lovo 细胞接种于含10%胎牛血清1640 培养基，置于37 、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的Lovo 细胞，实验分组为对照组(姜黄素0 mol/L，加入等量DMSO)，姜黄素5 mol/L，10 mol/L，20 mol/L，40 mol/L 组，处理后再置于37 、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h。
　　1.3 Real-time PCR
　　采用Trizo1 试剂一步法提取细胞总RNA ，紫外分光光度计测定总RNA 浓度，计算OD260/ 280，比值在1.8~2.0 的RNA 标本用于反转录。总RNA 按说明书进行逆转录反应合成cDNA，逆转录产物cDNA 用于Real-time-PCR 扩增。VEGF 引物：5 端:5 -GGGGGATCCGCCTCCGAA-ACCATGAACTT -3 及3 端:5 -CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGA-TCTGGTT-3， 变性、退火温度为94 与72 ，40 个循环。利用标准曲线，根据样品CT 值计算出样品中所含的模板量。
　　1.4 Western Blot
　　用蛋白提取液提取细胞蛋白， BCA 测总蛋白质浓度。蛋白样品用10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，上样量为20 g。5%脱脂奶粉TBS 缓冲液封闭，4 过夜， 加兔抗人VEGF 多克隆抗体( 1：500)室温2 h， 洗膜30 min， 加入羊抗兔二抗( 1：1000)室温结合1 h， ECL 显色， 内参采用-actin。采用Image -ProPlus6.0 图像分析软件对蛋白条带进行灰度分析。以VEGF 条带与内参-actin 条带的灰度比值代表VEGF 蛋白的表达水平。
　　1.5 统计方法
　　实验所得计量数据以(xs)表示， 采用SPSS13.0 软件进行方差分析和t 检验，以P0.05 为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 不同剂量
　　姜黄素对人结肠癌Lovo 细胞VEGF mRNA 表达的影响利用Primer 3.0 软件分别设计出扩增人VEGF 和GAPDHmRNA 的引物， Real-time PCR 检测VEGF mRNA 的表达， 见表1，并用EXCEL 做出各组VEGF mRNA 相对表达量柱状图表达，见图1，姜黄素5 mol/L、10 mol/L、20 mol/L、40 mol/L 组与对照组相比，VEGF mRNA 的表达均明显降低， 差异有统计学意义(P0.05)，且呈剂量依赖性。
　　2.2 不同剂量
　　姜黄素对人结肠癌Lovo 细胞VEGF 蛋白表达的影响不同剂量姜黄素处理Lovo 细胞， 收集细胞总蛋白， 用Western Blot 检测VEGF 蛋白的表达，并用Image-ProPlus6.0 对图像进行灰度分析，姜黄素5 mol/L、10 mol/L、20 mol/L、40 mol/L 组与对照组相比VEGF 蛋白表达均明显降低，差异有统计学意义(P0.05)，且呈剂量依赖性。
　　3 讨论
　　血管内皮生长因子VEGF 随着肿瘤增殖、侵袭和转移而表达明显升高。VEGF 信号还与肿瘤细胞的淋巴管、淋巴结侵袭及远端转移密切相关。梁启廉等研究发现VEGF 表达水平与大肠癌组织学分化程度、浸润深度、TNM 分期、淋巴结转移有关。且临床观察发现大肠癌患者术前血清VEGF 水平与大肠癌的浸润、转移密切相关。有研究者利用同源重组将结肠肠癌细胞系中VEGF-A 敲除后发现，当细胞缺失了VEGF 信号后，细胞的生长受到了明显的抑制， 且细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶的敏感性增强，而在临床上仅仅通过阻断细胞表面的VEGF 受体来治疗结直肠癌效果是有限的。目前研究发现， 姜黄素能够对消化系肿瘤有很好的抑制作用，其药理活性主要表现在能够下调核转录因子(NF-k B)的活性，诱导细胞周期停滞和细胞凋亡，抑制血管生成[9]。在人结肠癌HCT116 细胞中，姜黄素可有效抑制结肠腺癌细胞集落生长和侵袭能力。不同浓度姜黄素作用人结肠癌SW620 细胞24 h，增殖抑制显著。
　　该研究用4 种不同浓度的姜黄素分别作用Lovo 细胞24 h后，利用Real-time PCR 及Western Blot 方法检测VEGF 的mRNA及蛋白的表达，发现各姜黄素组(5 mol/L、10 mol/L、20 mol/L、40 mol/L)与对照组比较，VEGF 的mRNA 及蛋白的表达明显下降，差异有统计学意义(P0.05)，且姜黄素的作用浓度越高，VEGF的表达量越低，该作用呈剂量依赖，提示姜黄素能通过抑制人结肠癌细胞Lovo 中VEGF 的表达来抗结肠癌血管形成， 抑制结肠癌细胞的生长和转移。此结果与贾佳等的观点一致，他们发现姜黄素能够下调结肠癌细胞HT-29 中-catenin、VEGF 的表达。在多个结肠癌细胞系中， 均有研究证实姜黄素能下调VEGF 的表达，进一步可利用建立的结肠癌裸鼠移植瘤模型，从体内水平研究姜黄素能否下调瘤组织VEGF 的表达， 且姜黄素是否通过NF-KB 信通路来下调人结肠癌细胞VEGF 的表达， 该机制也有待进一步研究。VEGF 是抗癌药物治疗的新靶点，姜黄素作用后的人结肠癌Lovo 细胞VEGF 水平下降，提示姜黄素可能通过下调VEGF 的表达抑制了VEGF 促进肿瘤新生血管的作用，从而抑制了结肠癌的增殖和转移。该研究为姜黄素的临床应用提供新的理论依据。