谈川芎素对结直肠癌Lovo细胞生长的体内外抑制作用及机制

　　中药是我国的特色治疗方式之一，目前已有多种中药制剂获批用于常规手段无效时的肿瘤治疗。川芎素广泛用于心脑血管疾病的治疗，近年来其抗肿瘤活性成为研究的热点。川芎素对人结直肠癌是否具有抑制作用，目前尚不明确。2015年5月2016年5月，我们在体内外观察了川芎素对结直肠癌Lovo细胞的抑制作用，并探讨其可能的机制。
　　1材料与方法
　　1。1材料
　　川芎素（阿魏酸钠）成都制药一厂生产，100mg支，工作浓度100mgmL，人结直肠癌Lovo细胞购自中科院细胞库，RPMI1640培养基购自GIBCO公司；AnnexinFITCPI试剂盒购自南京凯基公司，鼠抗人proCaspase3单克隆抗体、鼠抗人Bcl2单克隆抗体购自Santa公司；SPF级裸鼠购自上海实验动物中心。
　　1。2实验方法
　　1。2。1细胞培养与分组处理37、5CO2下将Lovo细胞于含10小牛血清的RPMI1640培养基培养，将对数生长期的细胞分为两组。观察组分别与终浓度为0。125、0。25、0。5、1。0mgmL川芎素共培养，对照组不加川芎素。
　　1。2。2Lovo细胞活力观察采用MTT法。将对数生长期的细胞制成1105mL的细胞悬液，以100L孔接种96孔板，分组处理同1。2。1。培养24h每孔加入5mgmL的MTT20L，孵育6h每孔加入20的SDS50L孔，过夜，测定570nm吸光度（A）值。细胞活力指数（观察组A570对照组A570）100。
　　1。2。3Lovo细胞周期检测取对数生长期Lovo细胞，分组处理同1。2。1。培养24h后以70冰乙醇固定细胞，4碘化丙啶避光染色30min，用FACSCalibur检测细胞周期。
　　1。2。4Lovo细胞凋亡检测取对数生长期的Lovo细胞，分组处理同1。2。1。分别于培养6、12、24h，以3000L1缓冲液〔100mmolLHEPES（pH7。4），1。4mmolLNaCl，25mmolLCaCl2〕悬浮细胞，调整细胞密度为1106mL。取100L细胞悬液到流式管，加入5LAnnexinVFITC和10LPI（20gmL），避光孵育20min，加入400LPBS后用FACSCalibur检测凋亡细胞，计算细胞凋亡率。
　　1。2。5川芎素体内抑瘤作用观察取裸鼠14只，于其左腋下靠背部皮下注射Lovo细胞悬液100L。10d后待肿瘤体积至约100mm3，随机将裸鼠分2组各7只。观察组静脉注射0。5mgmL的川芎素50L，对照组静脉注射等量生理盐水，隔日给药7次。给药前及给药后每隔2d测量裸鼠瘤体长径（L）和短径（W）。肿瘤体积（mm3）12W2L。
　　1。2。6Lovo细胞及肿瘤组织Bcl2、proCaspase3检测采用Westernblot法。取对数生长期Lovo细胞随机分为两组，观察组与终浓度1mgmL的川芎素共培养，对照组不处理。收集培养24h后的细胞，并分离两组裸鼠肿瘤组织；抽提蛋白，SDSPAGE电泳后转PVDF膜，5BSA封闭；加入14000稀释的鼠抗人Bcl2单抗或15000稀释鼠抗人proCaspase3单抗，以12000稀释的鼠抗人actin作内参，4孵育过夜；加12000稀释的HRP标记的二抗，室温孵育1h；洗膜，检测并扫描，以目的条带与内参条带的光密度比值作为目的蛋白的相对表达量。
　　1。3统计学方法采用SPSS15。0统计软件。结果以珋xs表示，数据比较采用单因素方差分析及LSDt检验。P0。05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2。1川芎素对Lovo细胞活力的影响观察组分别与终浓度为0。125、0。25、0。5、1。0mgmL川芎素共培养24h后，其细胞活力指数分别为81。236。58、75。696。34、62。183。29、58。392。69。终浓度0。125mgmL与终浓度0。5、1。0mgmL的细胞活力指数比较，P均0。05。其他浓度间比较，无统计学意义。
　　3讨论
　　目前，川芎素已广泛用于治疗脑血管病、冠心病、白细胞和血小板减少症等疾病。川芎素药理作用复杂，研究表明其具有抗氧化及抑制血栓形成等效果，还有报道川芎素能够抑制氧化导致的平滑肌细胞增殖，但是川芎素和肿瘤细胞生长的关系研究较少。本研究结果发现，隔日瘤内注射0。5mgmL川芎素治疗荷Lovo细胞豚鼠，7次用药后，与对照组比较，其肿瘤体积明显缩小。这表明Lovo细胞的生长能被川芎素抑制，与本研究MTT实验结果相互印证。G1S期和G2M期是细胞周期两个重要检测点，在此期能够发现DNA的损伤甚至突变，阻滞受损的细胞于相应位点上并进行修复DNA，只有DNA修复完好后，接下来的细胞周期事件才能顺序进行；如修复不能完成，则会引发细胞凋亡。本研究结果显示，与对照组比较，观察组Lovo细胞经不同浓度川芎素作用24h后，G1期细胞比例减少显著，S期细胞呈明显堆积，且细胞凋亡率增加。表明川芎素既能阻滞细胞于周期当中，又能引发细胞凋亡。
　　作为细胞凋亡的通路之一，线粒体途径中有与凋亡相关的蛋白被线粒体释放，整个过程由Bcl2家族的蛋白调控。凋亡抑制蛋白与诱导蛋白都是Bcl2家族成员，Bcl2是凋亡抑制蛋白，抗癌药物的敏感性受其表达水平的影响。Caspase依赖性凋亡的执行者是Caspase3，其由胞质中的proCaspase3剪切而来，核酸内切酶CAD进而被激活，发生染色质聚集、DNA降解等生物学效应。本研究结果发现，川芎素能够降低Bcl2及proCaspase3水平，凋亡抑制可被Bcl2低水平表达解除，降低proCaspase3后Caspase3活化水平升高，最终引起细胞凋亡。
　　综上所述，川芎素阻滞了人结直肠癌Lovo细胞在S期，并抑制Bcl2的表达，Caspase3被激活，细胞转入凋亡步骤，在体内外抑制Lovo细胞的生长。