通脉丸有效组分配伍浓缩液在大鼠体内的毒代动力学讨论

　　通脉丸是由附子、黄芪、两头尖、制马钱子、当归、赤芍、甘草等中药组成的纯中药制剂，已有30余年的使用历史。具有祛风湿、通经络、消肿痛之功效，用于治疗血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化闭塞症、风寒湿痹、四肢惊挛等肢体缺血性疾病，临床疗效显著。
　　通脉丸方中毒性药材如马钱子是影响通脉丸安全有效的关键，马钱子的主要成分为生物碱，其中士的宁占总生物碱的3550，其次为马钱子碱。马钱子碱是其镇痛的主要成分，士的宁是其主要毒性成分。目前的研究显示，小鼠灌服给药，士的宁的LD50是马钱子碱的171。25，对中枢神经系统和免疫系统及肾脏有毒性作用，因士的宁的治疗剂量和中毒剂量比较接近，其吸收速率大于消除速率，长期、大量服用马钱子就会造成体内短时间内含量过高而引起中毒。因此本研究以通脉丸方中士的宁作为指标性成分进行其在大鼠体内的毒代动力学研究，得到相关的药动学参数，探讨其体内动力学过程的差异，从数据角度对通脉丸的安全性、减毒机制以及体内释放过程进行客观分析。
　　1材料
　　1。1仪器与试剂
　　HClass超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；ZRS8C智能溶出试验仪（天津大学无线电厂）；TGL16B离心机（上海安亭科学仪器厂）；QL901混匀仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；BF2000氮气吹干仪（北京八方世纪科技有限公司）；SartoriusCP225D电子天平（德国赛多利斯）；DT300A电子天平（上海医用激光仪器厂）；摩尔智能超纯水器（重庆摩尔水处理设备有限公司）；KQ100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；士的宁对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110705200306，纯度大于98）；磷酸二氢钾（天津市永大化学试剂有限公司，批号：20100110）；庚烷磺酸钠（山东禹王实业有限公司，批号：2010073001）；甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯（北京迪马欧泰科技发展中心）。
　　1。2实验药材
　　通脉丸方中各味中药有效组分提取液，由课题组成员徐丽军提供。处方所用药材由河南中医学院第一附属医院段晓颖主任药师鉴定，结果为：
　　制附子：毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx。的子根炮制品；批号：110107，产地：广西；
　　黄芪：豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus（Fisch。）Bge。var。Mongholicus（Bge。）Hsiao的干燥根；批号：110601，产地：内蒙古；
　　两头尖：毛茛科植物多被银莲花AnemoneraddeanaRegel的干燥根茎；批号：120308，产地：东北；
　　马钱子：马钱科植物马钱StrychnosnuxvomicaL。的干燥成熟种子；批号：111101，产地：广西；
　　当归：伞形科植物当归AngelicasinensisOliv。Diels的根；批号：110701，产地：甘肃；
　　赤芍：毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall的干燥根；批号：120310，产地：河北；
　　丹参：唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge。的干燥根及根茎；批号：120303，产地：安徽；
　　陈皮：芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco的干燥成熟果皮；批号：120303，产地：浙江；
　　洋金花：茄科植物白花曼陀罗DaturametelL。的干燥花；批号：120320，产地：江苏；
　　甘草：豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch。的干燥根和根茎；批号：120303，产地：东北；11琥珀：古代松科属植物的树脂埋藏地下后年久凝结而成的化石样物质；批号：110812，产地：云南。
　　1。3实验动物
　　清洁级Wistar大鼠，体质量30030g，雌雄各半，由山东鲁抗医药股份有限公司提供，许可证编号：SCXK（鲁）20080002。
　　2实验方法
　　2。1通脉丸方中各味中药有效组分配伍方案
　　通过对通脉丸的制剂处方分析，结合药效及毒性等特点将处方中各味中药为8组，两头尖、附子、马钱子为一组，黄芪、当归为一组，丹参、赤芍为一组，蜂蜜、甘草、陈皮、琥珀和洋金花分别各为一组。按照正交设计表L8（27）将其中除去两头尖、附子、马钱子这一组之外的7组为7个因素，得到8种不同配比，见表1。两个水平为有和没有。将这8种不同配比分别与两头尖、附子、马钱子这一组配伍得到八组灌胃用药。
　　2。2灌胃用药的制备
　　通脉丸方中各味中药的有效组分提取液由课题组另一成员徐丽军提供，徐丽军已测定饮片中指标成分的含量和所提取有效组分含量，计算出处方比例所需药液的体积。按照配伍方案设计将相应的有效组分提取液混合，浓缩至4。5gmL1的药液，其中蜂蜜为河南中医学院第一附属医院制剂室炼制的中蜜，琥珀粉碎直接加入药液。
　　2。3色谱条件
　　WatersAcquityUPLCBEHC18色谱柱（1。7m，2。1mm50mm）；流速0。18mLmin1；检测波长260nm；流动相：酸水乙腈（77：23），酸水：0。02molL1磷酸二氢钾与0。01molL1庚烷磺酸钠等量混合，并用10磷酸调体系pH为2。5；柱温30；进样量1L。
　　2。4对照品溶液的配制
　　精密称取士的宁对照品适量，加甲醇溶解，得到士的宁对照品储备液。
　　2。5方法学考察
　　进行线性关系、定量限、精密度、稳定性、提取回收率等试验考察。
　　2。6大鼠颈外静脉插管手术
　　2。6。1插管导管的制作
　　取PE管长度约11cm，管两侧剪平口。使用之前用记号笔做两处位置标记分别为3。5cm处和5。5cm处，在一端插入一枚大头针，将其在生理盐水中浸泡备用。
　　2。6。2插管手术
　　配制10水合氯醛溶液，按照300mgkg1大鼠的量进行麻醉，用电推剪剔去大鼠左侧颈胸部和颈背部的毛，用碘伏对手术区域及手术器械进行消毒。将已经麻醉的大鼠背位固定在大鼠固定台上。于大鼠颈中线偏左侧，从外上到内下做一个约1cm左右的纵切口，使用眼科镊剥离其皮下组织使其左颈外静脉显露并游离，结扎静脉远心端，在颈外静脉管壁制造出一个横向切口，沿此切口将插管插入颈外静脉。回抽有血，注入生理盐水后无渗漏则表明插管位置合适，用0。1mL的0。1肝素钠溶液封管后用大头针封堵插管，将管固定。将大鼠俯卧于大鼠固定台上，在其颈后部正上方作一个横切口，将固定好的插管从大鼠颈胸部切口引至颈背部切口，缝合切口，用碘伏消毒处理，插管完成。
　　2。6。3插管后的护理
　　手术完成后将大鼠单笼饲养，注意保暖。待大鼠清醒后注意观察大鼠有无异常、切口有无感染等，如果发现有异常应及时处理，术后隔天疏通导管，用0。1肝素钠溶液封管。
　　2。7血浆样品预处理方法
　　取待测大鼠肝素抗凝全血，4000rmin1离心15min，用取样器精密吸取上层血浆200L，置离心管中，加入2528氨水100L，置旋涡混合器上混合30s，然后加入甲基叔丁基醚1。5mL，再涡旋1min，离心10min，收集甲基叔丁基醚液；剩余物重复以上萃取操作一次，合并两次萃取液后40氮气流吹干。残渣加入甲醇100L溶解，涡旋，15000rmin1离心10min，取上清液进样测定。
　　2。8大鼠血浆样品测定
　　正常大鼠8组，每组各5只，给药前禁食12h，不禁水。给药前称体重，给药剂量为0。64mL药液100g大鼠，记下各只大鼠给药的准确时间，于给药后2、4、6、24、28、31、48、52、55h不同时间点大鼠静脉插管取血0。45mL，同时注入等体积生理盐水，全血置于含有肝素钠的离心管中备用。按照血浆样品的处理方法将血浆样品处理后，使用UPLC测定不同时间点的血浆药物浓度。
　　2。9数据处理
　　采用已建立的UPLC法测定不同时间点大鼠血浆中士的宁的浓度，以时间为横坐标，血药浓度为纵坐标，建立士的宁的血药浓度时间曲线以及各个组的平均血药浓度时间曲线；采用药动学软件Winnonlin5。2，计算各个组的毒代动力学参数。本实验所得的计量资料用均数标准差xs表示，各个组的毒代动力学参数比较采用t检验，P0。05为差异有显著性意义，其他配伍组的AUC与通脉丸原方组（第1组）的AUC进行比较，计算AUC减少率〔AUC减少率（）（通脉丸原方组AUC其他配伍组AUC）通脉丸原方组AUC〕。
　　3结果
　　3。1线性范围及最小检测限
　　取大鼠空白血浆200L，分别加入一定浓度的士的宁对照品溶液，制成系列浓度的对照品溶液，按实验方法2。7项操作，吸取上述一系列不同浓度血浆质控样品溶液1L进样测定峰面积，以士的宁峰面积对含士的宁血浆浓度进行线性回归，得回归方程Y10336665X148。8225，R0。9999，结果表明士的宁在进样量0。00004320。0108000g与峰面积呈良好线性关系，按峰高为基线噪音3倍计算，血浆中士的宁最低检测浓度为0。0432gmL1。
　　3。2回收率实验
　　将一定量的士的宁对照品溶液加入到空白血浆样品制成高、中、低3个浓度的样品，依实验方法2。7项下处理。测得血浆高、中、低浓度样品绝对回收率为85。4887。94，平均相对回收率为99。31105。54，RSD（）值均小于15，n6，符合生物样品含量测定要求。
　　3。3精密度实验
　　取大鼠空白血浆，分别加入高、中、低浓度士的宁对照品溶液，按标准曲线制备方法进行测定。日内差异：一天内重复5次，RSD（）均小于10，日内精密度良好。日间差异：每天测定一次，连续测定5天，结果RSD（）均小于10，日间精密度良好。
　　3。4稳定性考察
　　将生物样品按相应的2。7项下进行样品处理，室温25放置，分别在0、6、12、24h进样测定，结果RSD（）均小于15。样品在室温下24h内稳定性良好。20冷冻，室温下自然溶解，反复冻融3次，测得士的宁的浓度RSD值均小于15，显示血浆样品反复冻融3次后稳定性良好。
　　3。5毒代动力学研究结果
　　3。5。1不同时间点大鼠血浆样品中士的宁含量测定结果
　　大鼠灌胃通脉丸方有效组分配伍浓缩液后所测得的士的宁平均血药浓度时间数据曲线。
　　3。5。2士的宁在大鼠体内的药代动力学参数
　　选用非房室模型计算各组毒代动力学参数，包括：峰浓度（Cmax）、达峰时间（Tmax）、曲线下面积（AUC）、半衰期（T12）、清除率（CL）、表观分布容积（Vz），其中Cmax和Tmax为实测值，其余参数为拟合值。各组的毒代动力学参数，计算AUC减少率，各组AUC减少率结果。可以看出与通脉丸原方（第1组）比较，第2、5、6、8组AUC减少；第3、4、7组AUC增加。带入公式1计算得出AUC减少率大小顺序为第6组第8组第2组第5组第1组第4组第3组第7组，丹参、赤芍、琥珀、蜂蜜减毒作用最强。
　　4讨论
　　丹参、赤芍为影响士的宁含量的最主要因素与前期研究相符合。甘草蜂蜜水在临床上常用于马钱子中毒的解救，但在因素分析中，甘草和蜂蜜的影响作用均小于琥珀和洋金花。八组实验中除通脉丸原方组（第1组）外，同时含有甘草和蜂蜜的第7组士的宁的含量最多，已有研究的结果表明甘草中含有的酸性成分与马钱子中的生物碱成盐，降低生物碱在体内的毒性，分析实验结果与以后研究结果不相符合的原因一方面可能为第7组实验配伍中除了甘草和蜂蜜之外，还有另一个因素陈皮的有效组分，陈皮与甘草、蜂蜜产生了相互作用，影响了甘草、蜂蜜的减毒作用，另一方面可能为处方量的甘草和蜂蜜不足够产生减毒作用，同时经过单独的工艺优选后提取的甘草有效组分与蜂蜜配伍不能达到甘草与蜂蜜配伍后的减毒作用。
　　中药毒代动力学作为中药安全性评价研究中的重要部分，能够有效解释毒性试验结果和预测人体安全性，是连接毒理试验现象和人用中药可能发生的不良反应评价之间的桥梁。但中药复方化学成分的复杂性和多样性、中药配伍的变异性和机体状态的不可预测性，给中药复方药代动力学研究带来许多问题。因此应注重采用新技术、新方法，对中药复方的代谢过程及毒效机制进行探索，以寻求更好的复方药代动力学研究途径，为中药的临床安全性评价提供更为可靠的依据。本课题选择的是单次给药，采用灌胃给药的方式进行实验。毒代动力学是在毒性剂量下进行的实验研究，根据通脉丸方浓缩液急性毒性实验得出灌胃给药LD50为107。48gkg1，再结合课题前期研究结果确定给药剂量为28。8gkg1，相当于人临床服用剂量（按每天10g计）的33倍。