生物墨水基质粘弹性如何影响组织形态

　　细胞外基质环境的生物和物理因素调节了群体细胞动力学和组织样式。然而，基质的粘弹性特质如何调节群体细胞的在空间和时间上的行为仍是未知之谜。近日，哈佛大学的David J. Mooney教授研究团队在Nature Materials|生物墨水/基质粘弹性如何影响组织形态
　　基质的粘弹性促进了细胞团簇的不对称性增加，形成了侵入性指状突起，在体内和体外都可以观察到YAP核迁移和上皮-间充质转变（EMT）现象。通过上述观察结果的建模，研究建立了与基质粘弹性，组织粘度，细胞运动性和细胞分裂速率相关的形态学稳定性分析相图，其通过肠类器官的体外实验进行实验验证。总之，这项工作强调了应力松弛机制在组织生长动力学中的作用，揭示了组织生长动力学是形态发生和肿瘤发生的基本过程。
　　背景介绍
　　组织样式与许多生物过程相关，包括细胞数量，大小，形状和位置的改变，上述过程也可能导致组织对称性破坏，产生屈曲，折叠，撕裂，出芽或分支等现象。在分子水平上，组织的行为受内在基因表达和各种物理化学因素的调控。虽然化学物质梯度在发育生物学中起到关键作用，但是三维(3D)细胞外间质(ECM)中的力学刺激在调节组织和形态发生方面也同样起到关键作用。尽管已有大量研究探索刚度对组织结构中的影响，然而基质的粘弹性在组织发生中的作用尚不明确。
　　事实上，ECM的随时间改变的粘弹性特征越来越被认为是形态发生中的重要参与者，且基质粘弹性已经被证明可以调节单细胞行为，但是它是如何调节群体细胞行为还不清楚。研究人员假设了组织结构将受到基质的粘弹性特性的影响，设置了弹性固体到粘性液体等不同粘弹性组别，应力松弛时间范围从1秒到几百秒不等。实验结果明确证明了粘弹性基质/生物墨水在常用的体外发育和病理模型（乳腺癌生长和肠类器官发育）中可调节组织结构，同时证明了应力松弛可以影响组织生长动力学和手指样的不对称结构形成，是形态发生和肿瘤发生的基本过程。
　　基质材料/生物墨水的配置
　　文章首先研究了粘弹性生物墨水对 MCF10A 非恶性乳腺上皮细胞团簇组织生长的影响，MCF10A 乳腺上皮细胞以被广泛用于研究乳腺发育和肿瘤发生。选择由天然多糖海藻酸盐形成的水凝胶作为生物墨水，因为哺乳动物细胞不表达降解该聚合物的酶，从而消除与基质降解有关的影响。这些凝胶的相对粘弹性可以独立于刚度，孔径和粘附配体地改变。改变方法是通过改变海藻酸盐的分子量和钙交联剂的浓度来实现粘弹性变化，以创建固定弹性模量(G ′ 5,000 Pa)的生物墨水，但是不同组别应力松弛时间在30s到350s变化，具体为弹性体应力松弛时间更长粘弹性体改时间更短。由于海藻酸盐不存在整联蛋白粘附配体，所以将含有 Arg-Gly-Asp (RGD)的肽缀合到聚合物骨架上以在所有凝胶中提供恒定水平的细胞结合位点。
　　图1. A,示意图说明如何同时改变聚合物的分子量和交联程度允许在恒定的凝胶刚度下改变粘弹性能。B，所得海藻酸盐水凝胶的储存模量 (每个条件 n = 5,9个凝胶)。C，在一定应变下，最初施加的应力放松到原始值的一半的时间尺度的量化。D，MCF10A 细胞团簇在弹性和粘弹性水凝胶中生长超过5天的实例。青色，鬼笔环肽; 洋红色，Hoechst。面积(e)和圆度(f)的量化。G，在弹性和粘弹性凝胶中生长的 MCF10A 细胞球体中磷酸化 FAK 人黏着斑激酶。灰色，pFAK; 洋红色，Hoechst (每个条件 n = 3,4个图像)。H，弹性和粘弹性凝胶(球体核心细胞和分支细胞)中球体的鬼笔环肽(青色) ，Hoechst (洋红色)(上排)和 YAP (下排)染色的代表性例子。I，每个图像具有核 YAP 的细胞百分比的染色进行定量。
　　粘弹性生物墨水对乳腺癌团簇生长的影响
　　随着时间的推移，弹性基质中的组织生长缓慢，形态稳定; 它们在保持球形对称性的同时体积增大。然而，粘弹性基质中的组织生长得更快。随着尺寸的增加，它们表现出形态不稳定性，球形对称性被破坏，形成手指突出并侵入基质材料，导致表面积显著增加和圆度降低。这些差异是由生物墨水力学特性的变化引起的，研究接下来集中在细胞中的两个力学敏感通路，粘着斑激酶(FAK)和机力学敏感的转录调节因子 YAP。粘弹性生物墨水促进磷酸化的 pFAK 粘附的表达和形成，但弹性生物墨水中没有类似现象，而 YAP 保留在弹性生物墨水细胞的细胞质中，但在粘弹性生物墨水中移位到指状突出细胞的细胞核中。
　　A, 在粘弹性凝胶中生长的细胞团簇中波形蛋白(青色) ，鬼笔环肽(洋红色)染色。B，弹性水凝胶中球体外环和粘弹性水凝胶中指状突出中波形蛋白平均强度的定量。C, 鬼笔环肽和 Hoechst (左)和细胞角蛋白14(右)在粘弹性和弹性水凝胶球体染色的例子。青色，鬼笔环肽; 洋红色，霍克斯特; 黄色，细胞角蛋白14。D，球体外环平均细胞角蛋白14强度的定量。
　　E-g，弹性和粘弹性基质中球体中 Snail (e) ，Slug (f)或 Zeb1(g)阳性细胞百分比的定量。H，第0天用含有 MDA-MB-231乳腺上皮细胞的粘弹性和弹性水凝胶注射的小鼠中肿瘤体积的定量。I，在弹性和粘弹性水凝胶中 MDA-MB-231的鬼笔环肽和 Hoechst 染色。青色，鬼笔环肽; 洋红色，Hoechst。J，植入裸鼠体内的粘弹性和弹性水凝胶中 MCF10A 球体的鬼笔环肽和 Hoechst (左) ，线粒体(中)和波形蛋白(右)染色。K，植入小鼠体内7天的弹性和粘弹性基质中球体中的slug阳性细胞百分比的定量。
　　粘弹性生物墨水中观察到的行为更符合真实细胞行为，包括上皮-间充质转变(EMTs)。波形蛋白在指状突出中表达更高，细胞角蛋白在粘弹性基质中的细胞团簇中表达低，EMT 转录因子 Snail，Slug 和 Zeb1在粘弹性基质中的细胞中表达更高。此外，许多癌症相关通路在弹性基质内的细胞中没有改变，但在粘弹性刚性水凝胶中上调。为了确定粘弹性是否可以增强细胞团簇在体内的生长，我们采用了两种方法。
　　首先，在 NOD-SCID 小鼠体内注射包裹在粘弹性或弹性生物墨水中的MDA-MB-231恶性乳腺上皮细胞，肿瘤在粘弹性基质中的生长速度明显快于弹性基质。MDA-MB-231细胞在体外也生长得更快。其次，将包裹在粘弹性或弹性基质中的MCF10A 细胞团簇注射到 NU/J 小鼠体内。1周后，研究观察到粘弹性基质中细胞的显著生长和指状突出形成，而弹性基质中的细胞仅显示有限的生长。此外，体内的细胞在粘弹性生物墨水中表达更多的波形蛋白和 Slug。研究结果表明，基质粘弹性可以促进 EMT 和肿瘤生长。
　　粘弹性生物墨水对群体细胞行为的影响作用模型
　　为了理解组织形态对称性破坏的量化条件，研究引入最小系统理论模型，从限制在粘弹性生物墨水内生长的活性增殖细胞的两相系统开始。将组织中的单个细胞模拟为在粘性液体中大小一定的过阻尼软弹性球体，其在三种力的影响下移动: (1)细胞之间的相互作用，包括(a)短程排斥以防止重叠和(b)中间范围(两个细胞长度)的吸引力，两者一起产生由细胞分裂增殖驱动的压力；(2)细胞与周围粘弹性生物墨水之间的作用力包括(a)相互作用的吸引势，该值与储存模量 G ′相关和(b)防止重叠的短程斥力；以及(3)相对于彼此在生物墨水内随机移动的活细胞，拥有属性为运动能力M。此外，在该模型中，假定界面处的细胞具有对周围基质材料施加力的能力。整个系统随着细胞的增殖和/或迁移而变化，基质材料对伴随细胞施加的压力做出被动的反应。
　　当应力超过规定的阈值时，基质材料中细胞与基质之间的结合位点可能断裂，从而形成新的结合位点; 这最有可能发生在组织与基质材料的界面处，从而导致了边界的动态演变。其次，潜在的机制驱动组织运动和增殖的细胞规模进行了探讨。之前的研究认为，单个细胞对三维和二维粘弹性的反应是由肌动球蛋白收缩力或拉伸离子通道调节而导致。而该模型显示，细胞通过推动基质产生分裂和迁移的空间。与此相一致的是，当模型中的细胞增殖速率受到抑制时，预测组织生长和不稳定性将大大减少。对于弹性生物墨水中的细胞，细胞分裂将在空间上局限于生长组织和基质材料之间的边界，但是对于粘弹性基质中的细胞，细胞分裂将更广泛地分布在整个生长组织。另外基于上述假设的模拟预测随着基质材料模量的增加，组织形态不稳定性将增强。
　　A，组织的主动运动是基质刚度的正相关函数，B-D，最终时间点模拟图像，投影面积和圆度。通过进一步改变弹性和粘弹性凝胶中的交联程度，改变了实验生物墨水的刚度。F，实验样品在弹性和粘弹性的不同刚度基质材料培养5天的面积和G圆度。H，在细胞运动能力归零后的模型模拟结果。I，具有 Rac1(NSC23766)和 Arp2/3(CK666)抑制剂的软和硬粘弹性基质中培养5天后的样品。J，模型预测的弹性/粘弹性材料中不同刚度下的细胞增殖。K，不同培养条件下EdU 阳性细胞百分比。
　　粘弹性生物墨水对类器官生长的影响
　　研究也进行了粘弹性生物墨水对自组织肠类器官生长的影响评估。粘弹性生物墨水同样促进了肠类器官生长，对称性破坏和隐窝形成，但类器官在弹性生物墨水中生长更缓慢，并保持其球形对称。总的来说，这些结果验证了生物墨水粘弹性对组织生长影响模型的普适性。
　　A，用于类器官研究的海藻酸盐和基质胶共混生物墨水示意图。粘弹性受聚合物分子量和交联剂浓度控制，而 Matrigel 的浓度保持不变。B，弹性和粘弹性海藻酸钠-基质胶互穿网络的储存模量。C，培养7天的弹性和粘弹性水凝胶中的肠类器官鬼笔环肽和 Hoechst 染色。青色，鬼笔环肽; 洋红色，Hoechst。D，E，在弹性和粘弹性基质中7天内的类器官面积和圆度变化。F，在较硬的粘弹性凝胶中培养7天后Lgr5 + ，鬼笔环肽和 Hoechst肠类器官染色。左: Lgr5 + (洋红色)和 Hoechst (青色) ; 右: 鬼笔环肽。G，在较硬的粘弹性凝胶中培养7天后溶菌酶，鬼笔环肽和 Hoechst 染色。每个条件 n = 9个图像。左: 溶菌酶(洋红色)和 Hoechst (青色) ; 右: 鬼笔环肽。H，不同生物墨水中GFP+和聚落形成对比。
　　结论
　　该研究证明了粘弹性生物墨水如何调节群体细胞行为，暗示对称性的破坏与许多生理过程相关，包括胚胎发生，癌发生，分支形态发生和血管生成。同时提供一个思路来了解组织在正常和病理状态的形态，并用相图策略来指导组织形态调控和再生医学。
　　参考文献
　　Elosegui-Artola, A., Gupta, A., Najibi, A.J., et al. Matrix viscoelasticity controls spatiotemporal tissue organization [J]. Nature Reviews Materials, 2022: 1-15.
　　https://doi.org/10.1038/s41563-022-01400-4
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