流动相，作为高效液相色谱法重要的组成部分，它不仅仅是作为被分离物质的运载体，它更是直接影响到分离的好坏，测定的成功与否。流动相的物理、化学性质及其纯度，直接影响到色谱系统的稳定性、分离效率、分离速度、检测灵敏度。 01 在添加有机相后测量流动相的pH值 在水溶液中，pH值被校准以提供正确的pH值——你需要确认的缓冲液是水溶液。如果你用添加了有机相的水溶液来测量pH值，pH值就会与有机相添加前的pH值不同 。 然而，最重要的一点是要保持一致。如果你总是在添加有机相后测量pH值，确保你在方法中说明了这一点，以便每个人都用同样的方法。 它不会百分百准确，但至少会是一致的。这可能比精确的pH值更重要。 02 没有使用缓冲液 缓冲液是用来控制pH值和抵抗pH值变化的 。方法的许多其他部分(例如样品基质、空气中的二氧化碳、流动相中水的来源)可以改变流动相的pH值，从而导致保留、峰形和峰值响应的变化。甲酸，三氟乙酸等不属于缓冲试剂。 03 没有在缓冲液正确的pH范围内使用 每个缓冲盐有2个pH值单位范围，它提供了最佳的pH稳定性。在缓冲范围外面，盐对pH值的变化是无效的。要么在正确的范围内使用缓冲区，要么选择一个范围覆盖所需pH值的缓冲区。 04 将缓冲液加入有机相中 将水的缓冲液混合到有机相中，会导致缓冲液沉淀的高风险 ——在许多情况下，变化微小，以至于可能不太明显。常常是将有机物质添加到水相，这大大降低了缓冲沉淀的风险。 05 使用泵的梯度混合从0%开始 现代泵在混合流动相和在线脱气上非常有效，然而，并不是每个使用你的方法的人都有一个高质量的泵 。预混合你的A和B，混合成一个单一的溶液，在A管路上100%运行。 将950mL的水溶液与50mL的有机溶液混合，然后过滤和脱气。这降低了HPLC之间的可变性，降低了系统中气泡和沉降的风险。 注意，在泵上混合的95:5不会和在瓶中预拌的95:5相同的保留时间——你通常需要在预混合时添加更多的有机成分。 06 调节缓冲液的pH值 只使用你正在使用的缓冲盐的酸或碱 。举例来说，磷酸钠缓冲液应该仅用磷酸或氢氧化钠来调节。 07 缓冲液的全部信息 例如，将5g的磷酸钠放入1000ml的水中 缓冲剂的类型(单盐基，二盐基，三盐基)决定了它的pH缓冲范围。 所需的质量浓度决定了缓冲强度 。5g无水磷酸氢钠和5g一水合磷酸氢钠会有不同的缓冲强度，并会影响到保留。 08 用有机相的填充管路 如果前一种方法在B管路中使用了缓冲液，而你的方法在B管路中使用了有机相，那么缓冲液很有可能会在你的泵管路/泵头中沉淀。我在早期就这样做了，并且造成了很大的伤害。如果有怀疑——把它冲出来(用80:20水:有机相)。 09 最后一滴流动相被使用掉 如果没有足够的流动相来完成运行——将有50%的可能性，气体将会在最后几个样品的中运行。除了磨损你的泵和色谱柱走干的风险，流动相从表面蒸发，所以在瓶子顶部的流动相与大多数体积相比成分将会改变 。如果你使用瓶子里的最后少量的流动相，顶部的这个部分恰好是贯穿柱子的东西。 10 使用超声仪对流动相进行脱气 这对确保你所有的缓冲盐溶解都很好，但这是最不有效的脱气方法，它会迅速加热流动相，导致有机部分蒸发。节省你日后的问题——用5分钟的时间来过滤你的流动相 ——它会在一个步骤中脱气和过滤。下图为各种脱气的效率示意图！