为什么研发自闭症药物这么难？美国科学院院刊这篇论文或许能说明

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　　本期解读嘉宾：袁老师
　　■ 哈佛大学医学院脑科学博士后
　　■ 哈佛大学附属BWH脑科学专家
　　■ 小小神经元首席脑科学家
　　现代科学研究技术的迭代日新月异，在上一期的科学速递站中，我们就解读了大规模自闭症的最新基因研究（外显子测序），基于基因测序和计算机技术的发展，研究者们快速地鉴定出了102个自闭症相关基因。
　　这种速度和效率在过去根本无法想象，无疑大大加速了研究人员开发治疗手段的进程，但是，既然目前已经发现了这么多的自闭症相关基因，为什么还没有药物面世？
　　图片源自Pexels，与研究内容无关
　　因为针对每一项新的可能因素，从发现到临床应用都需要借用各种技术进行全面的研究，确认该因素是否切实影响自闭症症状、具体有什么样的影响、这些影响是如何起作用的、如何利用这些影响进行调节等一系列的问题。
　　本期科学速递站就为大家解读一篇发表在美国科学院院刊（PNAS）上的经典研究论文：发现一个自闭症基因后，研究人员是如何用实验充分验证其作用。
　　在这项研究中，科研人员利用特定的隐性遗传自闭症人群数据，发现了其中最显著突变的基因ACTL6B，然后在细胞模型、果蝇模型、小鼠模型、3D类器官模型和部分人体实验（MRI）共同验证了该基因对自闭症的作用，所采用的实验技术涵盖了外显子测序、RNA测序、细胞生物学、分子生物学、MRI、小动物行为学、显微技术等。
　　《美国科学院院刊》（PNAS，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）是与《Nature》、《Science》齐名，被引用次数最多的综合学科文献之一。自1914年创刊至今，《PNAS》提供具有高水平的前沿研究报告、学术评论、学科回顾及前瞻、学术论文以及美国国家科学学会学术动态的报道和出版。
　　《PNAS》由至少由一名美国国家科学院院士负责审稿，在SCI综合科学类排名第三位，因而已成为全球科研人员不可或缺的科研资料。
　　在SCIE所有期刊中，《PNAS》特征因子位列世界第二，有着很高的国际声誉，影响力巨大。
　　本文涉及专业内容，阅读难度较大，家长们可选择加粗的重点内容进行浏览
　　研究团队介绍
　　负责该项研究的Gleeson教授是UCSD圣地亚哥神经遗传所负责人，也是脑发育中心主任，其实验室研究目标是研究儿童脑部疾病的遗传基因基础。他在神经科学、遗传学和细胞生物学等领域开创了很多创新性项目，并且著有多篇脑疾病医学著作。
　　Gleeson教授多年来致力于为患神经发育疾病的儿童研究更好的诊断和治疗手段，专注于大脑皮层、小脑、脑干区域结构病变，他的实验室长期和多个国际单位合作联合研究自闭症等疾病，并开发针对这些疾病的治疗新方法。
　　主导该项研究的Gleeson教授
　　研究内容及成果
　　首先如何发现特定基因呢？
　　研究人员对一类特定的隐性遗传自闭症人群（SRAC, Simons Recessive Autism Cohort）进行了全基因组外显子测序，通过135个该类自闭症患者和256个隐性遗传其它神经发育疾病的对照组病人的测序结果显示，在所有编码基因中，ACTL6B基因在自闭症患者中发生最显著突变，而在对照组病人中并没有发现该突变。
　　进一步分析其编码的蛋白发现，ACTL6B可以特异性表达在大脑组织神经元细胞中，这提示了该基因很可能是一个具有重要功能的自闭症基因。
　　更具暗示性的发现是，研究人员还从这135个患者中找到了6个互相独立、且ACTL6B存在不同突变遗传的家族，在这些家族的患者中都能观察到癫痫的发生，同时并无性别差异的症状。
　　紧接上述发现，ACTL6B基因不同突变均可能和自闭症的发生相关，那么这些突变编码的蛋白在生物体内是什么情况呢？
　　研究人员利用慢病毒感染了HEK293T细胞株和ACTL6B敲除小鼠神经元，同时利用了2个自闭症患者的体外iPS神经干细胞，都发现了ACTL6B蛋白低表达，这符合隐性遗传疾病的特征：即蛋白保守区域会发生碱基删除、移码及错义（truncating, frame shifting or missense）。
　　进一步的，在构建的ACTL6B（果蝇中该蛋白名为Bap55）敲除的果蝇模型中，研究人员发现只有表达完整的ACTL6B蛋白——而不是其各种突变体——才能逆转其敲除引起的神经突触特异性，从而明确了该蛋白的功能。
　　在解析了该蛋白的作用后，接下来是需要进一步研究该蛋白是否会引起临床组织结构病变及其位置。
　　研究人员比较了ACTL6B突变自闭症患者和对照健康人的核磁共振（MRI）结果，发现该类自闭症患者的大脑白质组织减少，并发生明显的胼胝体发育不全现象。
　　而在ACTL6B完全敲除的小鼠中，其小鼠脑部胼胝体厚度比正常小鼠减少了约20%，而皮层等其它部位并没有发生显著变化。由于胼胝体的减少正是临床BAF突变型自闭症的诊断标志，ACTL6B作为BAF的15个亚基之一，其临床表型符合理论预期。
　　在确认了ACTL6B突变患者的临床表型之后，需要更多的实验数据来进一步评估该基因突变对自闭症的影响。
　　为此，研究人员利用ACTL6B敲除小鼠设计了各种社会行为学实验，如三厢实验、水迷宫实验等，来数字化评估ACTL6B敲除后对小鼠社交能力、学习记忆能力、运动能力等的影响。
　　实验发现，ACTL6B敲除对无论何种性别的小鼠，都会造成显著的自闭症型行为变化，即社交能力下降、学习记忆能力下降和重复刻板行为提升。
　　上述结果明确了ACTL6B基因在自闭症中的作用，那么最后，还需要探究它是如何产生该作用的。
　　作者利用体外培养7天的ACTL6B敲除及正常胚胎皮层神经元细胞，进行了RNA测序和ATAC测序，结果发现503个mRNA表达上调的基因和383个mRNA表达下调的基因（FDR<5%）。
　　而其中令人感到意外的是，ACTL6B敲除组中，上调基因大部分会和早期转录因子Nr4a2及AP1家族蛋白基因频繁地共表达。而这些基因一般在静息态神经元中保持较低水平表达，只有在神经活动时才会快速被诱发表达来调控＂晚期响应＂基因。
　　为了进一步探究该现象，作者们利用KCl处理神经细胞模拟神经活动，再次进行了RNA测序，结果发现534个上调和237个下调的＂早期响应＂基因（FDR<5%），且其中典型基因JUN, FOS，FOSB等在自闭症临床患者类器官模型中也得到了验证。
　　因此，通过这些数据分析可以推测：ACTL6B对自闭症的影响可能是其通过抑制神经活动响应的转录程序而带来的。
　　未来研究方向
　　该项研究首次发现了SRAC自闭症人群中最明显的突变基因ACTL6B, 并用细致的实验证据验证了其对自闭症的影响，同时也探究了其机制。
　　神经活动依赖的转录抑制和自闭症的发生存在一定联系，大部分自闭症基因都会有遗传背景或性别的影响，而ACTL6B在不同遗传背景或性别都会引起自闭症的发生，这意味着该基因的敲除动物可能会是很好的的自闭症研究模型。
　　需要注意的是，虽然该项实验已经进行了非常多的研究，但这还只是发现自闭症治疗靶点的第一步。
　　关于ACTL6B引起自闭症的具体分子机制在该项研究中并没有详细探究，其上下游信号通路也有待更充分的实验来开拓，该基因是否还有其它的生物学功能亦是未知。因此，对于ACTL6B相关药物的开发，未来还有很长的路要走。
　　图片源自Pexels，与研究内容无关
　　即便如此，于我们而言，这是一篇十分钟就能看完的研究解读；而于研究人员而言，这可能是数十人、数千甚至数万个日夜的奋斗成果，无论是今天分享这篇还是之前的文章，几乎所有研究人员都是在该领域耕耘了数十年。
　　但也正是有了这些科研人员的付出，我们才能对＂医药治疗＂心怀期待。同时，我们也要正视攻克自闭症治疗的难度，坚持用科学的、教育的方式进行干预——例如经《柳叶刀》发表证实的【家庭干预】法，最大程度发挥其作用，帮助孩子改善症状。
　　参考文献
　　[1] Wenderski, W., Wang, L., Krokhotin, A., Walsh, J. J., Li, H., Shoji, H., Ghosh, S., George, R. D., Miller, E. L., Elias, L., Gillespie, M. A., Son, E. Y., Staahl, B. T., Baek, S. T., Stanley, V., Moncada, C., Shipony, Z., Linker, S. B., Marchetto, M., Gage, F. H., … Gleeson, J. G. (2020). Loss of the neural-specific BAF subunit ACTL6B relieves repression of early response genes and causes recessive autism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 117(18), 10055–10066.