HPLC到UHPLC方法转换，一步到位

　　从HPLC到UHPLC的方法转换来提高实验室工作效率，在科学研究和质量控制过程中常常要在HPLC高效液相色谱和UHPLC超高效液相色谱两种检测分析方法之间进行转换。现代化的HPLC高效液相色谱仪和它的控制软件支持用户将这种方法移植到其他系统中使用，接下来就和小析姐一起学习一下吧。
　　在制药和食品工业以及其他不同工业领域中，HPLC高效液相色谱检测分析技术被广泛用于目标化合物或者杂质的定性、定量分析。近几年来由于检测效率和检验分析能力的原因，UHPLC超高效液相色谱检测分析技术已经进入实验室的日常工作中来了。
　　这两种技术的区别在于系统最大压力的不同。
　　由于UHPLC超高效液相色谱检测分析技术有着很高的压力稳定性,因此它可以在更短的时间内完成类似于高效液相色谱分析的任务。这种高端仪器设备主要是在科研领域中使用，以便能够尽快的设计出新的检验分析方法。在临床检验分析中也用到了UHPLC超高效液相色谱分析技术，以便通过快速的检测分析来提高检验效率、提高仪器设备的利用率。
　　然而在许多常规分析中仍然使用普通的HPLC高效液相色谱仪，这主要是因为它在质量监控和质量保证中非常坚固耐用、维护保养费用低廉。
　　在有着上述两种液相色谱系统的实验室中， 一方面是将HPLC高效液相色谱法的检验操作方法移植到UHPLC超高效液相色谱法中，旨在增加检验分析时的通量；另一方面又将专门为UHPLC超高效液相色谱法研制开发的、更加稳健的操作方法移植到HPLC高效液相色谱法中。
　　然而， 不同系统之间的方法转换不仅仅只是缩短了检验分析的时间，而且还有许多参数是方法转换过程中需要修改。
　　例如：流速、时间程序和色谱柱尺寸等，在HPLC与UHPLC之间的方法转换中这些参数都必须修改。另外，当您使用的色谱仪是不同生产厂家的产品时，这些参数也必须重新修改，不能一成不变的照搬。如果方法转换不成功，则会出现不同的洗脱结果、不同的检出率和不同的相对保留时间 – 简而言之：检验分析的结果没有可比性（参见图1）。到底哪些参数是方法转换时必须考虑的参数呢？
　　图1 以头孢菌素类抗生素为例，从HPLC简简单单的转换到UHPLC时存在的问题。色谱柱尺寸和检验分析条件
　　从HPLC转换到UHPLC最明显的变化是色谱柱的不同。超高效液相色谱仪的色谱柱较短、内径较细、粒径较小，但这还不是全部不同之处，在调整了色谱柱的规格尺寸之后还要调整检测分析的分离条件。适合于HPLC高效液相色谱法的最佳参数不能全部适用于UHPLC超高效液相色谱法，同样适合于UHPLC超高效液相色谱法的最佳参数也并不能全部适用于HPLC高效液相色谱法。
　　在两种色谱系统之间的方法转换时首先要注意下列参数：
　　•流速；
　　•时间程序（梯度、阀和事件的切换等等）；
　　•系统的死区容积；
　　•探测器的数据采集速率；
　　•注射量；
　　•系统的最大压力。
　　重新编写时间程序是必不可少的工作之一，尤其是在梯度分析中。只是缩短分析时间而不对梯度的时间程序做相应的调整会明显的改变分离效果。在规定的分离条件下，相对保留时间和洗脱顺序常常是规定好的，因此为了成功的实现方法转换就必须调整时间程序。
　　两种色谱法之间所有相关参数的调整匹配用手动方式转换，是一件非常费时费力的复杂事情。为了避免这些麻烦、减少困难，一些液相色谱系统的供应商提供了成功实现方法转换的参数换算程序、甚至（U）HPLC超高效-高效液相色谱系统专用的转换方法。  可靠的双向方法转换
　　方法转换系统是一种特殊的超高效-高效液相色谱法的转换系统，其配用的软件是在HPLC和UHPLC两种系统之间双向的计算转移条件的软件。它有两条独立的流路，一条应用于HPLC高效液相色谱仪连接，另一条用于与超高效液相色谱仪连接，因此可以实现无缝互换。
　　将HPLC与UHPLC在一个单元中组合起来带来了许多好处。首先是可以在一个系统中成功的实现方法转换，只需要验证一个色谱设备就可以了。这当然也减少了实验室的空间占用、减少了仪器设备的维护保养需求。另外，这一系统可以使用不同的实验套件来调整系统的容积，这就大大的方便了不同生产厂家色谱仪之间的方法转换了。
　　利用软件附带的方法参数的换算程序和方法转换工具（参见图2）可以方便的实现新、旧（U）HPLC系统的转换。在新旧系统之间的转换时，只要打开现用HPLC或者UHPLC方法的窗口，输入新、旧色谱柱的规格尺寸、所需的最终流速就可以了。软件会自动的计算出其他所有参数，计算的结果可以直接作为新方法保存下来，无需人工手动一个个输入参数。
　　图2 软件中的方法转换工具方法转换的实例
　　•头孢菌类抗生素的快速分析：头孢菌素是口服或者注射剂量的β-内酰胺类抗生素，在本例中，首先用HPLC高效液相色谱法对11种头孢菌素进行了分离，然后在方法转换工具的帮助下测定UHPLC超高效液相色谱分离中的最佳参数。图3将色谱图和它们使用的分离方法一同表示出来了。
　　通过HPLC到UHPLC的方法转换，在相同的洗脱模式下分离时间缩短了三倍。在HPLC每分析一次，分离需要的时间为65分钟，而在UHPLC分离则可以在17分钟内得到相同的分离结果。
　　图3 以头孢菌素分离为例，从HPLC转换到UHPLC的最佳转换
　　•常规应用磺胺类药物分析：磺胺类药物是一组合成抗菌素，用于治疗感染和化疗等其他疾病。本例是将UHPLC方法转换到常规的HPLC方法中去。根据新的色谱柱尺寸，利用方法转换工具将九种磺胺类药物的UHPLC方法转换成在HPLC高效液相色谱法中使用的分离方法。
　　各自的色谱图和分析分离条件如图4所示。转换到粒径较大、尺寸较长的色谱柱后，分离时间也从超高效分离时的5分钟延长到了大约20分钟，但分离效果几乎是一样的。
　　图4 以磺胺类药物分析为例从UHPLC转换到HPLC的最佳转换
　　方法转换的原因是多方面的： 转换到UHPLC超高效液相色谱法是会缩短检测分析的时间，转换到HPLC高效液相色谱法时确保了常规分析的稳定性。手工调整检测分析参数的方法是费时费力的，而且相当复杂。
　　利用软件工具将现有的方法转换的到新的（U）HPLC系统中去是现在最安全的、易于用户使用的，而且也是最省时省力的替代方案。利用特殊的组合系统，例如将两个单独的UHPLC系统与和HPLC系统用Nexera-i MT组合在一起就不需要再对两套系统独立验证了，而且这一方法还可以方便地在HPLC系统和UHPLC系统之间进行双向切换。