干货如何处理细胞篇代谢组学样本？

　　全文共 4335 字，阅读大约需要 8 分钟   细胞代谢组学实验研究主要包括细胞的收集、淬灭、提取。今天小析姐就来和大家一起分享代谢组学细胞样本如何进行收集？淬灭？提取？帮助大家更好的开展细胞代谢组学的研究工作。
　　细胞代谢组学是系统生物学的重要组成部分，利用代谢组学的分析技术对细胞内外的小分子代谢物进行定性定量分析的研究，观察细胞内外代谢物的浓度变化，从整体的角度系统全面的观察细胞水平上代谢物的变化。在环境胁迫、药物药效、疾病发病机制等重多领域均具有广泛的应用。细胞不同于其他的样本，它的代谢物丰富但含量较低且不易收集或收集不完全，因此需要一种有效可靠的处理方法来获得更为全面的代谢物信息。   细胞的收集
　　相比血清和组织样本，细胞中代谢物丰富但含量较低，在进行代谢组学实验时一般需要培养并收获至少10-6个细胞， 为确保代谢物能够尽量且全面的被仪器所检测，建议收集10-7个细胞进行代谢组实验 。
　　常用的细胞收集方法主要有2种：
　　1、 胰蛋白酶酶解细胞；
　　2、无菌刮刀刮取细胞。
　　Huichang Bi等研究人员比较胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）处理和刮刀刮取的方式对人胰腺癌细胞（PANC-1）进行代谢物的分析并对提取效率进行评估，发现 胰蛋白酶处理过程中多数代谢物的提取率均低于刮刀刮取 （图1）， 蛋白酶解过程中破坏细胞膜，使得细胞膜的通透性增强，代谢物发生泄漏，造成提取效率较低 。
　　Zhang等选用人心肌细胞（AC16）、大鼠心室心肌细胞（NRVCMs）分别使用胰蛋白酶处理和直接在乙腈中直接刮取细胞这两种采集方式进行了比较，发现 胰蛋白酶处理引起代谢物的泄漏 。
　　因此在细胞代谢组学的研究过程中 ，不建议进行胰蛋白酶处理，建议去除培养基后 采用刮刀刮取的方式获取细胞，以尽量减少代谢物的损失，获取更多的代谢物信息。
　　图1 胰蛋白酶酶解和直接刮取对代谢物提取效率的影响细胞的淬灭
　　淬灭是 为了使细胞中的酶失活，终止细胞代谢，减少实验误差。理想的淬灭溶剂应能够 立即抑制细胞代谢活性，同时不破坏细胞膜，防止细胞内代谢物的泄漏 。
　　常用的淬灭方式：
　　1、加入低温有机溶剂；
　　2、加入低温等渗溶液；
　　3、加入液氮。
　　Hounoum等人对鼠神经元细胞进行3种淬灭方法的比较，分别为-40℃甲醇、-20℃甲醇以及迅速在-80℃冻存后加入4℃甲醇进行淬灭，发现-40℃甲醇是较为理想的淬灭方式（如表1）。Lorenz等人在在细胞淬灭前 用生理盐水快速冲洗，能提高灵敏度且不影响代谢变化 。生理盐水冲洗后，应立即加入低温淬灭剂淬灭细胞，以减少代谢物的变化。Dietmair S等研究人员对比了60%的甲醇和0.9%生理盐水在0.5℃条件下淬灭效果，发现用60％甲醇淬灭方式导致细胞内代谢物的泄漏。相反，用 低温等渗生理盐水（0.9％NaCl，0.5℃）淬灭不会破坏细胞并可有效地阻止ATP转化为ADP和AMP，这表明代谢停滞且细胞完整无损 （图2）。
　　众多研究发现，仅以甲醇为淬灭剂会引起部分代谢物的泄漏，故 建议不要单独使用100%甲醇作为淬火溶液 。通常 建议使用与细胞内等渗的溶液（如0.9％无菌生理盐水），可维持细胞内外的离子强度，保持细胞完整性的同时尽量防止细胞内代谢物的泄漏。
　　表1、3种不同的萃取方法的比较
　　图2 不同淬灭溶剂的评价细胞代谢物
　　由于细胞中含有丰富的代谢物，因此提取方法至关重要。迄今为止 没有任何一种方法能够适用于所有的代谢物的提取。 研究人员一直在寻找较为合适的代谢物的提取方法，尽可能的把细胞内代谢物提取出来，以最大程度的减少代谢物的损失。细胞代谢物的提取过程主要取决于以下2点：
　　1、有机溶剂的选择
　　不同的有机溶剂提取的代谢物类别不同，一般会根据 相似相溶 的原理进行选择。细胞代谢组学领域运用最广泛的提取方法为液液萃取法， 常用的提取剂有甲醇/水、乙腈/水、甲醇/氯仿等 ，研究可 根据实验目的进行选择， 优化提取溶剂。
　　2、细胞的裂解方式
　　为获得尽可能多的细胞内代谢物，应使得细胞尽可能最大程度的进行破碎。常用的破碎方法有：
　　（1）反复冻融；
　　（2）超声破碎；
　　（3）机械匀浆（均质化） 。
　　反复冻融由于温度变化较大，对代谢物有一定影响，因此小编不建议使用反复冻融进行细胞裂解。建议通过后面2种方式进行细胞裂解。 细胞裂解后通过离心处理，取上清液进行分析或进行冻干处理。细胞样本可重复进行均质化处理，以确保最大限度地提取代谢物。 为了增加仪器的检测 ，还可对提取液 进行浓缩处理 ，以便在小体积内分析出最大数量的代谢物。这可以通过 真空浓缩或低温冷冻干燥 来实现。
　　细胞样品的前处理是代谢组学研究的第一步，是保证后续实验的可重复性和结果的可靠性重要一环。小编认为对于难以提取的粘壁细胞进行提取及冲洗时，可通过对冲洗剂和冲洗次数的评价，构建样本提取与洗涤之间的线性关系，以达到用最少浓度的洗涤剂尽可能得到更多的细胞。小编建议可通过与细胞渗透压相似的溶液（如生理盐水）对粘壁细胞进行提取，因为这样即可以收集更多的细胞，并且不会破坏细胞壁的完整性，且具有较强的可操作性。