抗体纯化四部曲

　　引言
　　随着细胞培养工艺灌流和连续流工艺革新和改进，抗体产量从每升几百mg提高到5-10g甚至更高到50g/L以上，大规模抗体生产的＂瓶颈＂和生产成本逐渐从抗体表达转移到了抗体纯化，因此对提高纯化通量和效率，降低成本的需求越来越大，成为抗体生产工艺研究的一个重点。
　　提高抗体纯化效率一方面可以通过优化现有纯化工艺设备、方法和工艺，挖掘现有纯化技术的潜力。另一方面则可以通过开发创新性的介质和工艺，从根本上突破现有技术障碍。
　　概述
　　抗体分离纯化的主要目的是将抗体与工艺相关杂质和产品相关杂质分离，最终获得高纯度、低潜在危害的抗体药物。
　　纯化过程中需要去除的工艺相关杂质包括细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸及培养基与加料液成分，需去除的产品相关杂质主要包括抗体片段和聚集体。纯化过程还需具备足够的病毒灭活去除能力，以去除宿主细胞自身表达的内源病毒样颗粒和未及时发现的外源病毒。
　　大多数工艺利用ProteinA来捕获抗体，并利用了至少1个离子交换层析作为精纯步骤，仅少数工艺使用了疏水、羟基磷灰石和分子筛层析等步骤。
　　图1中显示了一个常见的抗体纯化工艺。反应器收获液首先经过离心和过滤，去除细胞和细胞碎片，然后经过ProteinA层析捕获抗体,捕获后的抗体经低pH孵育后，通过两个离子交换层析进行精纯,然后进行病毒过滤，最后换液并调整抗体浓度，得到抗体原液。
　　工艺中的低pH孵育和病毒过滤是两个正交的专属病毒去除灭活步骤。这两个专属步骤与层析步骤一起，可大大降低原液中可能存在的病毒数目。
　　图1 抗体纯化工艺流程
　　第一话 离心、过滤
　　抗体为胞外分泌型表达，纯化的第一步是将培养液上清与细胞及细胞碎片分离开来。在实验室规模，分离可通过简单批次离心完成，但大规模抗体生产主要采用连续分离的方法，主要包括深层过滤、切向流过滤和连续流离心。
　　深层过滤的优点是简单易用，前期投入低。深层过滤介质的孔径分布较广，内表面积大，可依靠孔径截留和内表面吸附双重作用去除固体颗粒，比单一孔径滤器能处理更大量的固体杂质，且流速更快。
　　深层过滤系统由一系列的滤器组成，介质的孔径从上游到下游递减（见图2） 。深层过滤本身不能达到无菌过滤，所以过滤系统的最后一级通常需要一个无菌滤器。深层过滤介质中含有硅藻土，硅藻土在抗体纯化条件下带正电荷，在去除细胞和细胞碎片的情况下，还可以去除部分带负电荷的宿主细胞核酸和宿主细胞蛋白质，起到初步纯化的作用。
　　深层过滤的缺陷是一次性滤芯使用费用高和处理量有限，在处理大体积培养液时需并联多个滤器，费用和占地面积显著增加，所以深层过滤的试用范围限于100-2000L的中试规模的抗体纯化。
　　图2 深层过滤系统切面图
　　切向流滤器在灌流反应器部分较为常用（见图3） ，其高切向的流速可减少细胞在膜表面的沉积，从而可以处理大体积细胞培养液而不造成膜的堵塞。
　　切向流的流速越高，细胞沉积越少，但同时带来的剪切力越高，细胞破碎风险越大。细胞破碎形成的细胞碎片更容易阻塞滤芯，并且细胞破碎释放的胞内蛋白和核酸将大大增加后续纯化步骤的压力。
　　切向流滤器的使用以中空纤维最为普遍，其表面积大，又可以在孔腔内形成高剪切力。中空纤维滤器的工艺放大可通过增加纤维数目完成，简单易行。
　　在切向流过滤工艺开发和优化方面，需要考虑的包括滤芯化学成分、滤芯表面积、孔径、切向流流速、跨膜压力。
　　切向流过滤存在死体积，可在过滤后期加人少量缓冲液，降低死体积中的抗体含量，减少抗体损失。切向流过滤处理量大，可用于超过10000L细胞培养的分离，达到每小时近5000L的液体处理量。其局限在于滤器费用较高，过滤时间较长，并且过滤速度的可控性低。
　　图3 切向流滤器切面图
　　连续流离心，尤其是采用碟片式离心机进行的连续流离心，是大规模抗体生产中主要采用的分离模式。
　　碟片式离心机腔体为锥形，细胞培养收获液在靠近轴部加入，离心后上清液从轴部附近排出，细胞在离心力作用下，在锥形的底部边线附近聚集结块。
　　腔体定期在细胞聚集处轻微开启，利用腔体内的压力将细胞排出。细胞排出夹带的液体损失可通过离心力（转速） 、腔体开启频率和开启时间的优化，控制在5%以下。
　　连续流离心能够去除绝大部分细胞和细胞碎片。残留的少量细胞碎片可用深层过滤去除。碟片式离心机的优点是体积小，多层碟片形成的沉降面积大，液体处理量大，操作简单、可靠，使用费用低。其缺点是前期设备投资髙，清洗较复杂，并缺少合适的小试模型。
　　连续流离心机与沉降器一样利用细胞与培养基的密度差实现固液分离。图4显示的是一个商业化的碟片式连续流离心机。细胞培养液自离心机底部进料，在离心力的作用下，细胞在腔体的最外围富集。
　　上下腔体周期性地短暂打开，释放清除腔体内积累的细胞，这部分细胞返回反应器。细胞培养液上清自离心机顶端收获。连续流离心分离速度快，液体处理量大，可实现高达3600L/d的灌流速度，细胞分离效果高于90%，有很好的应用前景。
　　连续流离心机的弱点是设备和操作相对复杂，机械和操作故障风险相对较高。同时离心时形成的细胞团有可能造成局部营养缺失或副产物积累，其程度和影响需进一步考察。连续流离心机在操作时还需考虑细胞的剪切力耐受性，避免细胞损伤。
　　图4 连续流离心机切面图
　　第二话：亲和层析
　　亲和层析是利用待分离组分和其特异性配体间具有特异性亲和力，从而达到分离的目的。
　　原理：亲和层析是基于生物分子与其它配基分子之间（如抗原与抗体，酶和底物，激素与受体，核酸中的互补链，多糖与蛋白复合体等） 的亲和吸附原理建立起来的。
　　蛋白质与层析载体上的配体通过共价键、范德华力、疏水力、静电力等作用发生生物学专一性结合形成复合物，共价链接在载体表面的功能团配体上。蛋白质亲和层析技术通过目标蛋白质与配体间通过特异性亲和力吸附而达到分离纯化的目的，具有生物专一性的特点，纯化效率高。
　　ProteinA是金黄色葡萄球菌的一种膜蛋白，具有与抗体特异性结合的能力，ProteinA亲和层析柱已成为应用广泛的纯化抗体的亲和柱，可从腹水，血清和细胞培养上清或细胞抽提物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc片段的基因工程重组蛋白。
　　天然ProteinA由5个IgG结合域和其他未知功能的非Fc结合域组成，分子量42KD，天然ProteinA对IgG的亲和能力很强，可以吸附大量IgG（见图5） 。但同时，天然ProteinA的其他非结合域和非目标蛋白结合，这样被洗脱下来的蛋白纯度不够，会影响到后续的试验。
　　运用基因工程技术，克隆出ProteinA的基因，并对其结构改造，除去了一些不重要的非结合域。偶联这种重组RroteinA的琼脂糖凝胶柱在蛋白纯化中，的确提高了产物的纯度。一般使用具备较少B结构域的ProteinA柱能获得高纯度的IgG，洁洗脱条件温和，从而防止蛋白质集聚，保护蛋白活性。
　　图5 ProteinA的结构示意图
　　抗体纯化的一个显著特点是ProteinA亲和层析的广泛应用，超过2/3上市抗体品种的生产使用ProteinA进行抗体捕获。ProteinA对抗体重链稳定区Fc有很高的特异性和亲和力，对抗体纯化有很好的通用性。
　　ProteinA对IgG的高亲和能一步去除培养上清中大部分杂质，包括核酸、宿主细胞蛋白和可能存在的病毒，抗体纯度达到95%或更高，收率近100%。ProteinA层析操作简便，离心过滤后的细胞培养液可直接加载，不需经过任何处理。
　　抗体加载后，先用缓冲液淋洗，去除与介质或抗体弱结合的杂质，然后利用强酸性缓冲液（pH3.0-3.5） 洗脱ProteinA上结合的抗体，再利用酸性更强的缓冲液（PH约2.0） 去除强结合杂质，进行介质再生。ProteinA的清洗可以使用盐酸胍、尿素或低浓度碱液。
　　ProteinA亲和层析还是一个有效的抗体浓缩步骤，洗脱液中的抗体浓度可达10g/L以上，大大缩小后续精纯的液体处理量。
　　ProteinA亲和层析工艺开发和优化的重点是抗体载量、停留时间（流速） 、淋洗和洗脱条件。Shukla等考察了14个IgG抗体的ProteinA纯化，发现不同抗体间存在很大的差异，抗体的动态载量相差3倍（10-40g/L） ，洗脱需要的氢离子浓度相差一个数量级（pH3.0-4.1） 。
　　利用相同的工艺，洗脱峰中宿主细胞蛋白浓度可以从接近完全清除到残留21OOOppm，聚集体浓度可以从1%-20%，说明即使使用类似的平台技术，也需对特定的抗体进行特定的工艺开发和优化。
　　ProteinA在使用过程中会发生脱落，脱落的主要原因是细胞培养液上清中含有蛋白水解酶，在上样过程中会对ProteinA进行水解。部分脱落的ProteinA与抗体结合，残留在洗脱液中。由于ProteinA具有免疫原性，需在下游精纯步骤中加以清除。
　　ProteinA虽然在抗体纯化中被普遍接受，但改进和寻找ProteinA替代物仍是抗体纯化研究的一个重点。
　　ProteinA在拥有高特异性、高亲和力和高通用性等优点的同时，也具有若干显著缺点，包括费用高、载量低、线性流速有限、需低pH洗脱、ProteinA脱落等。
　　ProteinA亲和介质比普通纯化介质贵大约10倍，在抗体生产成本中所占的比重高于其他任何一个原材料。抗体在ProteinA上的载量较低，动态载量通常在20-30g/L，造成介质用量高，进一步提高了使用成本。为控制生产成本，ProteinA通常会重复使用。
　　实验证明，利用较温和的清洗步骤，ProteinA介质可以重复使用高达300次。为了降低介质成本，大规模抗体纯化通常采用较小的ProteinA层析柱，将单批收获液分成多批进行ProteinA纯化，减小了纯化通量。ProteinA上样是亲和纯化的速度限制步骤。Ghose等建议，可利用双重上样流速缩短上样时间。
　　在上样初期，当抗体容易到达的结合位点为空时，采用高流速，等到抗体容易到达的位点被占领，抗体必须通过扩散达到孔内结合位点时，再采用低流速，给抗体更多的扩散时间，达到较高载量。
　　天然结构ProteinA在强碱清洗时会降解，所有只能使用低浓度碱液（约0.lmol/LNaOH） ，尿素或盐酸胍进行清洗，但尿素和盐酸胍废液处理困难，不适于大规模生产，而低浓度碱液在内毒素清除方面的能力有限。
　　MabSelectSuRe（GE） 是一个改构的ProteinA，替换了ProteinA中易在碱性条件下降解（脱酰胺化） 的天冬酰胺，从而使得重组ProteinA可以耐受强碱的清洗。
　　在改进ProteinA的同时，寻找和设计可以替代ProteinA的配体也是一个重要的研究方面。具备替代ProteinA潜力的配体包括多肽、适配子、化学合成配体等，但目前这些配体在结合力、特异性和通用性等方面还不能全方位达到ProteinA水平，离商业化应用尚有距离。在今后的5-10年里，ProteinA还将是占主导位置的抗体捕获介质。
　　第三话 离子交换层析
　　离子交换层析应用最为广泛，目标物质和带相反电荷的介质以静电力的作用结合，然后在用高离子或改变pH的方式进行洗脱。
　　特别要注意，蛋白的pI表征的是蛋白表面的净电荷，然而离子交换层析时是蛋白的局部电荷和介质作用，另外离子交换介质吸附的一类物质，如阳离子交换介质吸附带正电荷的物质，所以在纯化过程中，需要配合层析过程进来合理的结合及洗脱过程，才能达到预期的结果（原理见图6） 。
　　图6 离子交换层析原理示意图
　　阳离子交换是另一个较常用的抗体捕获方法。至少有4个（Humira、Synagis、Soliris、Zenapax） 在欧美上市的治疗性抗体药物采用了这种捕获方法，另外多个处于临床阶段的抗体品种也采用了阳离子交换捕获方法。
　　阳离子交换与ProteinA相比的最大优势是成本。离子交换介质价格仅为ProteinA的1/10，可重复使用百次以上，并耐受强碱清洗。另外，阳离子交换介质的抗体载量可达100g/L，是ProteinA的2-5倍，可降低介质使用量。
　　Arunakumari等开发了一个基于阳离子交换抗体捕获、阴离子交换精纯的两步抗体分离方法。在大大降低纯化成本，缩短纯化时间的同时，阳离子交换层析捕获收率达到82%，捕获后抗体纯度超过97%，作者显示此工艺可成功放大1000倍。
　　阳离子交换与ProteinA相比有两个劣势，一个是特异性差，另一个是通用性差，需针对不同抗体和抗体表达工艺进行优化，如不同抗体的等电点不同。即使是同一抗体，不同的翻译后修饰也造成不同的等电点，这些都影响到阳离子交换缓冲液pH的选择。
　　捕获后的抗体需进一步去除宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、抗体聚集体、抗体片段和脱落ProteinA，以达到对患者安全的纯度。精纯一般采用两步层析以保持足够的纯化冗余，但采用一步精纯的工艺也越来越多。
　　精纯步骤常用的方法包括阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水作用层析、羟基磷灰石层析和分子筛，其中阴离子交换和疏水作用采用流穿模式，阳离子交换和羟基憐灰石采用结合-洗脱模式。各个层析步骤的主要杂质去除能力见表1。
　　两步精纯工艺一般会选择一个流穿模式，一个结合-洗脱模式，而单一步骤精纯一般会选择流穿模式（因为捕获步骤为结合-洗脱模式） 。精纯介质通常采用高效介质（直径10-30um） 以提髙分离的分辨率，同时提髙抗体的回收率。但采用小粒径介质同时也限制了流速，延长了纯化时间。
　　表1 层析步骤对杂质的清除作用
　　离子交换是最常见的精纯步骤。经典的抗体纯化步骤采用流穿的阴离子交换和结合-洗脱的阳离子交换两步精纯。阴离子交换对宿主细胞核酸和宿主细胞蛋白有很好的清除作用，而阳离子交换是去除多聚体和抗体片段的有效步骤。离子交换依靠抗体和杂质表面所带电荷差异将其分离。
　　抗体的电荷来自多个组成部分。赖氨酸、精氨酸、组氨酸可带负电荷，天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸可带正电荷，N-端的氨基可带正电荷，C-端的竣基可带负电荷，糖基化上唾液酸可带负电荷。
　　抗体上的净电荷取决于抗体的等电点和缓冲液的pH，当缓冲液pH低于等电点时，抗体带正电荷；当pH高于等电点时，抗体带负电荷。所以，通过调整缓冲液的pH，可以改变其在离子交换介质上的结合和流穿。需要指出的是，虽然一半以上氨基酸本身不带电荷，但它们会通过结构影响抗体的表面电荷，也会影响邻近酸性或碱性氨基酸的电荷。
　　阴离子和阳离子交换的区分在于介质上的活性基团，阴离子交换介质上的活性基团为阳性（带正电荷） ，可吸附流动相中的阴性离子，阳离子交换介质上的活性基团为阴性（带负电荷） ，可吸附流动相中的阳性离子。活性基团还可进一步分为强活性基团和弱活性基团，区分的标准是活性基团上所带电荷是恒定的还是随pH改变的。抗体纯化使用的一般为强活性介质。
　　离子交换层析首先要平衡介质
　　在介质上加载相反电荷离子，主要是钠离子或氯离子。平衡液选择的标准是抗体（结合-洗脱模式） 或杂质（流穿模式） 易于取代平衡时加载的反荷离子吸附在介质上，但吸附又不能太强或不可逆，从而易于洗脱。
　　第二步是样品的加载
　　样品加载时的缓冲液为低盐溶液，以促进抗体（结合-洗脱模式） 或杂质（流穿模式） 与反荷离子交换，在介质上的吸附。
　　第三步是淋洗
　　对于流穿模式，淋洗可采用平衡液，对于结合-流穿模式，淋洗可采用平衡液或可洗脱弱结合杂质的缓冲液，提高洗脱抗体纯化。
　　结合-洗脱模式的第三步是洗脱，洗脱依靠的是增加流动相中的盐浓度，增强反荷离子与抗体在介质上的竞争，从而洗脱介质上吸附的抗体和其他物质，洗脱下物质的顺序是从弱结合组分到强结合组分。
　　通过优化洗脱条件，可增加抗体与杂质在洗脱峰中分离的分辨率，从而有效去除杂蛋白、聚集体、抗体片段等杂质。离子交换的最后一步是再生，利用高盐缓冲液清除结合在介质上的所有物质，并在介质上重新加载反荷离子，准备下一个循环。
　　离子交换缓冲液中的缓冲体系应该在设定pH范围提供足够的缓冲能力，没有毒性，并且与抗体和介质没有相互作用。通常缓冲组分与介质应带相同电荷，所以不会在介质上吸附。线性洗脱可提高洗脱的分辨率，但在大规模生产中，为保证操作的稳定性，一般采取阶梯洗脱。
　　越来越多的公司开始使用一步精纯来提高收率和纯化速度，降低成本。Kelley等开发了一种一步精纯的弱分离阴离子交换层析（WPC） 方法。
　　弱分离阴离子交换层析操作条件介于流穿与结合-洗脱之间，采用比流穿操作更低的离子浓度，以提高流动相中的杂质与介质的结合能力，提高了本步骤的杂质去除能力。低离子浓度同时也增加了抗体在介质上的吸附，造成部分抗体吸附在介质上（大部分抗体流穿） 。
　　这部分弱吸附上抗体可以通过一个短暂的淋洗洗脱，保证抗体收率。Kelley等显示，ProteinA捕获和弱分离阴离子交换组成的两步抗体纯化工艺可满足抗体在宿主细胞蛋白、ProteinA、内毒素和宿主核酸的清除要求。聚集体的清除较为复杂一些。
　　对于部分抗体品种，聚集体比单体的吸附能力强，聚集体可以采取WPC方法去除，但对另外一些抗体品种，单体比聚集体与阴离子交换介质的吸附能力更强，这样品种就只能通过筛选阴离子交换介质或采用结合-洗脱阴离子交换方式去除聚集体。
　　在上一节介绍到，Arunakumari等在阳离子交换抗体捕获的基础上，采用一步阴离子交换精纯的两步抗体分离方法，可将宿主细胞蛋白和核酸降低到足够低的水平。
　　抗体纯化技术的另一个进展是膜层析技术日益广泛的应用，尤其是在阴离子膜层析方面。阴离子交换层析膜与填料层析介质使用的是同样的活性基团，但膜层析具有如下几个显著优势。
　　一是速度快，膜层析通过对流方式，使杂质能够直接接触到膜上所有的结合位点，开放式模孔结构利用分子扩散，可同时保证高流速和高载量。
　　二是载量高，膜层析动态载量可高达l-10kg/L膜体积是填料层析的10-100倍。三是体积小，缓冲液用量降低。膜层析回收率可达95%-100%，在宿主细胞蛋白去除、核酸去除及病毒去除能力方面也与填料层析类似，具备替代传统填料层析的优势。膜层析为一次性使用，在成本上比循环使用的填料高。
　　讲一讲：疏水层析
　　疏水层析和反相层析分离物质的依据是一致的，利用疏水介质的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离。
　　该方法基于的是蛋白质的疏水差异，在高盐溶液中，蛋白质会与疏水配基相结合，而其他的杂蛋白则没有此种性质，利用此种性质，可以将蛋白质初步的分离，用于盐析之后的蛋白质进一步提纯。
　　蛋白质的疏水性强弱取决于其表面疏基团的分布，同时与样品缓冲液的离子强度，离子种类，pH，所处的温度都有一定的关系，在进行疏水层析时要保持恒定的温度，且要对样品缓冲液的离子种类及离子强度，pH进行筛选对比分析。
　　第四话 病毒去除与灭活
　　抗体生产常用的CHO和NS0细胞系都分泌内源逆转录病毒样颗粒。这些颗粒不具备感染能力，但为了安全，需加以清除。
　　在细胞培养中，环境或原材料中夹杂的外源病毒有可能感染并利用细胞大量复制。外源病毒感染有可能通过在线或离线检测发现，及时终止生产，阻断传播。但病毒感染也有可能不能及时发现，造成病毒随抗体药物进人下游环节。
　　需要指出的是，虽然存在这种间接感染的可能性，到目前为止还没有发现任何通过使用抗体药物感染病毒的案例。
　　控制病毒风险需要从三方面入手：
　　控制原材料和工艺，减少病毒污染； 利用原材料和中间产品检测及时发现污染；三是在纯化步骤中建立足够的病毒灭活去除能力，清除未发现的病毒。
　　抗体纯化中的各层析步骤都有不同程度的病毒灭活去除能力，尤其是阴离子交换。在阴离子交换中性上样条件下，病毒带负电荷，会吸附在阴离子交换介质上，而抗体则带正电荷流穿。蛋白A亲和层析和深层过滤也有很强的病毒去除能力。
　　Zhou等发现，常用的深层过滤器对4种测试的模型病毒都有显著的去除作用，其中对鼠细小病毒的去除能力超过4Log1010。在纯化步骤本身的病毒去除能力基础上，抗体纯化还包括两个正交的专属病毒灭活去除步骤，即低pH孵育和病毒过滤。
　　病毒种类繁多，对病毒去除灭活的敏感度不同，需使用具有广泛代表性的病毒作为模型病毒加以研究和验证。Miesegaes等分析了提交到美国FDA的抗体药物申报材料，发现逆转录病毒、细小病毒和疱疹病毒是病毒去除灭活验证最常使用的模型病毒。
　　3种病毒中的逆转录病毒和疱疼病毒为包膜病毒，体积大，理化抗性低。细小病毒则是无包膜病毒，体积小，理化抗性高。逆转录病毒中又以鼠白血病病毒最为常用，细小病毒中又以鼠细小病毒最为常用。采用鼠白血病病毒的原因是用于模拟宿主细胞自身表达的内源性逆转录病毒样颗粒。鼠细小病毒可以感染抗体生产用的主要宿主细胞，且体积小、理化抗性高，用来模拟难以去除的外源病毒。
　　ICHQ5A要求至少使用三种病毒进行病毒去除验证；而实际上一般会采用四种病毒进行病毒去除验证。MVM、MuLv、PRV以及Reo-3是目前CHO体系病毒去除验证较为使用较多的病毒（见表2） 。
　　表2 CHO体系病毒去除种类要求
　　Miesegaes等的总结数据显示，对于逆转录病毒和疱疹病毒，蛋白A亲和、阳离子交换、阴离子交换、低pH孵育、50nm病毒过滤和20mn病毒过滤等纯化步骤都有较好的去除或灭活能力。
　　除阳离子交换层析清除逆转录病毒效率稍低（>3Log10） 外，其他各步骤的平均清除能力都超过4Log10。对于体积小、理化抗性高的细小病毒，低pH孵育、蛋白A层析、阳离子层析则没有显著的去除灭活效果，仅阴离子交换和20nm病毒过滤的去除能力超过4Log10。
　　低pH孵育是专属的病毒灭活步骤，对包膜病毒有极强的灭活作用。低pH造成病毒包膜上的蛋白结构、膜结构、衣壳结构变化，从而去除病毒的传染能力。低pH孵育步骤可以方便地置于ProteinA层析后，在低pH洗脱液的基础上，调整pH，进行0.5-2小时的孵育。
　　Brorson等系统研究了pH、时间、温度、抗体浓度，缓冲液渗透压，宿主细胞杂质，抗体聚集在低pH孵育中对鼠白血病病毒的灭活作用，发现在很宽的操作条件下，低pH孵育能可靠地实现超过4-6Log10的滴度（见图7） 。
　　需要指出的是，低pH对抗体有多种不利影响，包括促进抗体聚集、断裂、加速脱酰胺化等，所有在确定孵育pH、孵育时间等参数上，需要平衡考虑对病毒灭活和抗体质量的影响。
　　低pH孵育完成后，利用Tris等弱碱溶液进行中和。在中和过程中常会伴有沉淀产生，这些沉淀主要是宿主细胞蛋白和核酸等杂质，可通过深层过滤去除。增大细胞分离步骤使用的深层过滤面积可以减轻pH中和步骤沉淀产生。低pH孵育对鼠细小病毒等无包膜病毒没有明显的灭活效果。
　　图7 低pH孵育灭活病毒动力学曲线图
　　国内IND申报时，一般选择低pH和膜过滤这两个工艺。国外进行申报时，除了选择低pH和膜过滤，还需进行层析工艺。
　　层析法最常用的是亲和层析和离子交换层析。层析法是目前常用的样品不同组分分离技术，利用各组分与固定相亲和力的差异或相互作用不同的原理，实现病毒与样品分离的目的。国内的指导原则虽然没有硬性的规定，但通常需要做三个批次。
　　在国外的指导原则中，明确指出至少分别做两次独立的研究来证实清除的可重复性，因此一般是一批样品重复两次（见表3） 。
　　表3 国内外申报资料病毒去除和灭活的比较
　　病毒过滤是另一个专属的病毒去除步骤，通过纳米级的孔径截获抗体中的病毒。病毒过滤受工艺本身变化的影响很小，是可靠的病毒去除步骤。
　　在抗体纯化工艺中，小孔径（去除20mn及以上病毒的细小病毒） 滤器的应用远远超过大孔径（去除50mn及以上的逆转录病毒） 滤器。这主要是因为低pH孵育对细小病毒无去除灭活作用，需要20mn滤器作为有效的小粒径病毒去除步骤。
　　Miesegaes等的总结说明，50mn滤器的鼠细小病毒的平均去除效果在2Log10左右，而20nm滤芯的去除能力能达到4Log10以上。
　　病毒过滤主要采用死端过滤。死端过滤操作简单，而切向流过滤在操作复杂的同时，其剪切力有可能造成抗体聚集。病毒过滤滤器价格昂贵，单位膜面积价格是无菌滤器的10倍，所以在工艺优化中需提高单位面积通量，以降低生产成本。
　　病毒过滤通常置于纯化完成之后，减轻杂质对滤膜的阻塞。尽管如此，病毒过滤前需要使用0.2um或0.1um的无菌滤器或深层过滤滤器进行预过滤，进一步去除宿主细胞杂质和抗体聚集体。
　　死端病毒过滤使用空气在上游储罐保持固定压力，压力越高，单位体积的过滤速度和载量越高，但压力不应高于滤芯建议的使用压力。
　　在过滤过程中，过滤速度会逐渐衰减，衰减速度直接影响到过滤的载量。抗体浓度对过滤有直接影响，浓度增加，过滤速度降低。浓度降低，需要滤过的液体体积增加。具体最佳的抗体浓度，需要针对性地通过实验确定。
　　讲一讲：超滤换液
　　超滤膜系统是以超滤膜丝为过滤介质，膜两侧的压力差为驱动力的溶液分离装置。超滤膜只允许溶液中的溶剂（如水分子） 、无机盐及小分子有机物透过，而将溶液中的悬浮物、胶体、蛋白质和微生物等大分子物质截留，从而达到净化和分离的目的。
　　超滤在治疗性蛋白以及试剂蛋白的纯化过程中是比较关键的步骤，用于替换缓冲液和浓缩。小规模的时候，水和小分子可以通过离心或压力的方式透过半透膜，蛋白浓度在膜表面浓度会变得很高，在抗体超滤过程中，尤其在低温过程超滤时，易出现浑浊现象，而加入精氨酸可以降低聚体的形成。
　　治疗性抗体由于需要高剂量，因此需要超滤至高浓度，高蛋白浓度会形成高粘度，而且需要更合适的处方，然而超滤过程中形成高蛋白浓度与小的亲水半径有关，甚至是2nm，在proteinA层析低pH洗脱的时候也出现小的水合半径，只有溶菌酶的10倍小。这主要是由于处于低盐或pH下，静电作用不能完全被隔离，而在高蛋白浓度下，过量的体积占主要作用。
　　综合以上所述
　　纯化的整个层析过程：
　　1、平衡
　　使层析柱处于可使用的状态，用于维护良好的结合条件并定义色谱曲线的基线零点。
　　2、上样
　　目标分子与介质能够充分，均匀有限接触，实现结合的过程。上样量，上样流速等对分离过程都有很大影响，需要实验摸索最佳上样过程。
　　3、洗杂
　　将介质表面，孔内，间隙残留的未和介质结合的物质洗掉。
　　4、洗脱
　　将结合在介质上（包括孔内和表面） 的物质逐步洗脱下来，洗脱过程又可分多步进行，把结合强弱不同的物质分开，实现分离的目的。
　　5、维护
　　维护包括再生，清洗，消毒，保存。
　　另外抗体纯化的主要任务为：
　　1、工艺优化
　　亲和工艺、精纯工艺、除病毒灭活与过滤工艺；
　　2、小试纯化
　　用于药理、毒理、稳定性等研究提供样品；
　　3、 工艺放大及中试生产将优化后的工艺进行规模放大，使其适用于200L工艺，同时生产出用于临床申报的产品；
　　4、文件书写
　　用于临床申报及工艺转移的文件。