通过分离菌的胞外代谢组学推断生物结皮中微生物与代谢物关系

　　对于研究土壤化学及肠道微生物的科研工作者最关注的问题莫过于想明确土壤中或肠道中的微生物与其周围物质的相互作用关系，即哪种菌消耗了哪些物质又释放了哪些物质，这对探寻土壤有机质的循环、土壤营养和了解肠道菌群对宿主的代谢调控有着至关重要的作用！
　　代谢组学蛋白组学文献分享，今天就跟大家分享一篇2018年发表在Nature Communications上关于如何探索土壤微生物与代谢物关系的文章，文章中除了提供简单明确的研究思路以外，还使用了比16SrRNA基因测序更可靠的物种注释方法，让我们一起来详细了解一下吧！
　　1研究背景
　　本篇文章的研究对象是生物结皮（biocrusts），这是一种在干旱半干旱区中重要的地表覆盖类型，是由细菌、真菌、藻类等隐花植物及其菌丝、分泌物等与土壤砂砾粘结形成的复合物，与其他土壤一样，生物结皮中也存在有机质（SOM），其在保持土壤湿度、增加微生物多样性方面起着重要的作用，代谢组学蛋白组学文献分享，同样，微生物群落多样性和丰富度与不同生态系统中的土壤（包括极地土壤，农业土壤和干旱土壤）有机物也呈现出正相关的关系。
　　现在一般认为由土壤微生物循环的有机物质是微生物代谢物的复杂混合物，可以通过土壤代谢组学详细的描述其特征，并可由此推知微生物与代谢物的关系。
　　代谢组学蛋白组学文献分享，本研究中，作者对生物结皮中不同润湿时间和不同演替阶段中代谢物及微生物的动态变化进行了分析，并且通过生物结皮中分离培养菌体与其代谢的胞外代谢物关系（释放和消耗）来预测活性生物结皮中与其亲缘关系密切的微生物与相应代谢物的关系。
　　2研究方法
　　1.分组设置：
　　实验组：4个生物结皮演替阶段（A-D，如图1），5个润湿时间，每组5个重复，共100个样本。
　　对照组1：无菌超纯水（3个重复），可扣除背景噪音。
　　对照组2：高温灭菌4次的生物结皮（D阶段，5个润湿时间点，3个重复），为了排除非生物因素（如光解、吸附作用等）导致的代谢差异而设置。
　　图1 生物结皮的四个阶段
　　2.研究方法：
　　代谢组学（5个生物学重复）、宏基因组学（1个生物学重复）、转录组学（其他学者的数据）
　　3.检测平台：
　　实验组：正模式: Q-TOF； 负模式: QE ；
　　对照组2：（正负模式）QE
　　宏基因组： Illumina HiSeq 4000
　　4. 数据分析：
　　Matlab R2016A: 多因素方差分析和多重比对分析 ；R: Spearman’s 相关性分析、the exact binomial test；KEGG pathways。
　　5. 实验流程：
　　图2 实验流程图
　　需要说明的是，黄色标记的Exometabolomics是本文作者同一实验室工作人员在2016年发在Nature Communications上的研究结果，在这里做一下简单描述，方便后面对本篇文章的理解。
　　2016年的文章要点：
　　（1）从生物结皮（与本研究为同一位置取样）中分离培养了7种菌（1种鞘藻属菌的光合自养型菌和6种异养型菌）。
　　（2）经过对生物结皮中丰度较大的鞘藻属菌体的细胞提取物代谢谱与其消耗的基本培养基代谢谱的比较发现，该菌细胞中的物质绝大多数被释放到培养基中（对生物结皮则是被释放在土壤中）（如图3，绿色为细胞提取物，蓝色为被消耗的基本培养基中代谢物），因此可以以该细胞提取物来模拟生物结皮环境。
　　图3 Microcoleus vaginatus PCC 9802细胞提取物与消耗的基本培养基代谢物比较
　　（3）分别在基本培养基中添加上述鞘藻属菌体的细胞提取物和6种异养型菌的细胞提取物以模拟生物结皮环境，然后分别培养6种异养型菌，代谢组学蛋白组学文献分享，最后比较空培养基代谢谱和被菌体消耗后的培养基代谢谱，物质含量降低则视为被菌体消耗，含量升高则视为由菌体产生，从而确定这6种菌与相应代谢物的关系。
　　3研究结果
　　1.代谢物随润湿时间和演替阶段呈现出规律性变化，且润湿时间对代谢物变化的影响大于演替阶段。
　　图4 生物结皮中的代谢物分布类型
　　通过对不同润湿时间和演替阶段下物质的聚类发现，物质主要聚集成3类Cluster1、2、3。
　　Cluster1：主要是脂肪酸，在不同演替阶段的早期含量最多，且随时间变长而减少；
　　Cluster2：主要是极性氨基酸及核苷酸碱基，在3min-18h含量较多，且随后含量降低；
　　Cluster3：在比较晚的时间点及较成熟的生物结皮中累计较多。
　　为了比较润湿时间和演替阶段两因素对代谢物变化影响的强弱，根据物质的峰面积做了主成分分析（图5），可以发现润湿时间在第一主成分方向区分的更明显，不同演替阶段在第二主成分方向较明显，因此说明润湿时间对代谢物变化影响更大。
　　图5 PCA得分图
　　2. 由于生物活性造成的不同演替阶段代谢物的动态变化
　　为了探讨这些物质的变化哪些是由生物活性引起的，作者将不同演替阶段及润湿时间物质变化情况与高温灭菌对照组做了比较，发现有53个物质在至少一个阶段是与高温灭菌对照组有显著差异（图6标＂*＂的物质），其他物质则是由非生物因素造成。
　　图6 与高温灭菌组相比活性生物结皮中代谢物的动态变化
　　3.宏基因组推断微生物群落结构及润湿时间和不同演替阶段中群落结构的变化情况
　　在对代谢物做了初步分析之后，作者又对样本进行了宏基因组测序，但是物种注释的方法使用的是更稳定可靠的核糖体蛋白基因来注释的，而非16SrRNA基因测序。与16SrRNA基因测序相比，核糖体蛋白基因有以下3个优点：
　　核糖体蛋白基因在几乎所有基因组中都作为单拷贝存在；
　　宏基因组数据集中组装效果好（通常优于16S rRNA基因）；
　　保守性好并且产生了更高分辨率的系统发育树。
　　表1 生物结皮宏基因组中识别出的17种核糖体蛋白基因
　　作者从组装的基因中共定性出17个核糖体蛋白基因（表1），其中L15核糖体蛋白基因群落覆盖范围最广，达466个，因此选用该基因作为物质注释和丰度计算。代谢组学蛋白组学文献分享，通过对微生物群落结构分析发现，蓝细菌门在不同阶段润湿早期（3min）和晚期（49.5h）丰度显著减少由3 min的17–28%到49.5h:1–3%；而厚壁菌门则在不同阶段润湿早期（3min）和晚期（49.5h）丰度显著增多，由3 min的4–5%到49.5h: 19–39%。其他菌门（如放线菌门、变形菌门）均无明显变化，即受润湿作用影响较小（图7）。
　　图7 不同润湿时间和不同演替阶段微生物群落分布（门水平）
　　4.组装rplO基因与分离培养菌体rplO基因比较
　　为了根据前面提到的16年文章微生物与代谢物的关系推断本研究生物结皮中微生物与代谢物的关系，作者将本研究中宏基因组组装的rplO基因与16年文章中分离培养菌体的rplO基因做了序列相似性比较，保留了相似度超过86%的菌体，并且计算了平均核苷酸均一性（ANI），共有四种菌与先前分离培养的菌有较高的匹配度，见表2，表示这几种菌与分离培养菌亲缘关系较近，且可分别代表一类菌体。另外，这四种菌在整个微生物群落中占比也超过了30%，属于优势菌种。
　　表2 分离培养的菌体与其对应生物结皮中亲缘关系较近的菌种
　　在比较16年代谢结果与本研究代谢结果后，发现有32个共有物质，但有9个是由非生物因素引起，排除后剩余的23个物质挑选出来，根据其峰面积与上述匹配的生物结皮中的四种菌进行了相关性分析，并与16年得到的微生物与代谢物的关系（消耗或产生）进行比较。代谢组学蛋白组学文献分享，按照预期，被消耗的代谢物与菌体丰度应该成负相关，被生成的代谢物与菌体丰度成正相关（图8），通过spearman相关性分析后找到了48种微生物-代谢物之间的关系，其中69%有跟预期相符的关系。
　　图8 生物结皮中微生物与代谢物的预期关系
　　以食物网的形式展示该关系可见图9，该图中红色实线表示该物质被释放，且微生物与代谢物的关系与16年文章结果一致，虚线则表示不一致；蓝色实线表示该物质被消耗，且微生物与代谢物的关系与16年文章结果一致，虚线则表示不一致。代谢组学蛋白组学文献分享，并且绘制了C阶段三种菌的丰度随润湿时间变化的曲线（下面的灰色曲线），可见润湿早期，Microcoleus sp.（鞘藻属）丰度迅速升高，随着润湿时间的推移，将胞内物质释放到周围环境中，此时芽孢杆菌Bacillus sp. 1（芽孢杆菌1）和Bacillus sp. 2（芽孢杆菌2）利用鞘藻属菌体释放的物质丰度开始逐渐增多，而Microcoleus sp.（鞘藻属）丰度则逐渐降低。说明Microcoleus sp.是初级生产者，主要为其他异养微生物提供营养。
　　图9 三种生物结皮中主要微生物的食物网
　　注：Blastococcus sp.由于该种菌受润湿作用影响不显著，因此在曲线图中并显示。
　　5.转录组验证
　　后面作者又对上述结果做了简单的验证，作者通过对其他学者做的生物结皮（也与本研究取样地点一致）的转录本数据进行了KEGG通路分析，发现氨基酸合成途径均增加，相同氨基酸的分解代谢基本不变或者稍微增加（图11）。代谢组学蛋白组学文献分享，这也与在代谢物聚类分析（图1）中cluster2中主要是氨基酸类物质，且在润湿早中期含量较丰富一致。
　　图10 M. vaginatus 基因表达随润湿时间变化情况
　　4结论
　　大多数土壤代谢物在润湿事件和生物结皮发展阶段显示出与四种优势细菌的预期关系（正相关或负相关）。
　　代谢组学蛋白组学文献分享，研究结果表明，代谢物分析、宏基因组鸟枪测序和胞外代谢组学可以成功地整合到微生物群落结构与代谢物组成的功能分析上，将土壤微生物与土壤化学组织联系起来，以确定复杂生态系统中微生物的胞外代谢物网络。