细胞冻存与二甲基亚砜

　　利用冻存技术将细胞置于196液氮中低温保存（细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，），可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。细胞冻存时向培养基中加入保护剂终浓度515的甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用慢冻快融的方法能较好地保证细胞存活。
　　想一下，菌种保存常用的两种方法？1。固体斜面培养基临时保藏2。甘油管藏（20）步骤
　　（一）细胞冻存
　　1。配制含10DMSO或甘油、10～20小牛血清的冻存培养液；
　　2。取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。
　　3。去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；
　　4。离心1000rpm，5min；
　　5。去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5106ml～1107ml；
　　6。将细胞分装入冻存管中，每管1～1。5ml；
　　7。在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
　　8。冻存：标准的冻存程序为降温速率1～2min；当温度达25以下时，可增至5～10min；到100时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入20冰箱2h，然后放入70冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
　　（二）细胞复苏
　　1。从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37温水中，并不时摇动令其尽快融化。
　　2。从37水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
　　3。离心，1000rpm，5min；
　　4。弃去上清液，加入含10小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37培养箱静置培养；
　　5。次日更换一次培养液，继续培养。注意事项
　　1从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；
　　2将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
　　3冻存和复苏最好用新配制的培养液。
　　二甲基亚砜
　　二甲基亚砜结构式
　　一种含硫有机化合物，分子式为（CH3）2SO，常温下为无色无臭液体，可燃，带有苦味。凝固点18。4，沸点189，与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为万能溶剂。细胞冻存中的应用
　　在细胞冻存中的应用二甲基亚砜是一种重要的渗透型细胞保护剂。在低温（零下200度）保存细胞时冻存过程中，为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤，要使用含有DMSO冷冻保护剂。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。超低温时二甲基亚砜的细胞毒性受到抑制。复苏时动作要快，尽快洗掉二甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒性。二甲基亚砜（DMSO）是最好的细胞冻存保护剂，
　　它是一种渗透性保护剂，对细胞毒性小，分子量小，溶解度好，能迅速透入细胞，降低冰点，提高细胞膜对水的通透性，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结之前透出细胞外，在胞外形成冰晶，提高细胞内的电解质浓度，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞冻伤。
　　纯二甲基亚砜的冰点是18。45，含水40的二甲基亚砜60不冻，
　　在医疗中的应用
　　DMSO对许多药物具有溶液性、渗透性、本身具有消炎、止痛，促进血液循环和伤口愈合，并有利尿、销静作用。能增加药物吸收和提高疗效，因此在国外叫做万能药。各种药物溶解在DMSO中，不用口服和注射，涂在皮肤上就能渗入体内，开辟了给药新途径。
　　1。抗炎
　　发炎是组织对直接外伤（筋肉扭伤、刀伤、灼伤、震动、辐射等）或间接伤害（如感染）的反应。发炎涉及到疼痛、发热、泛红、肿胀和丧失功能。这是机体包围受伤部位的特殊方式，以便机体修护患处。DMSO能够减低发炎的严重度。
　　DMSO可以改善全身的血液循环。它似乎可以扩张大血管，收缩毛细血管床。这有助于减少患部的肿胀和体液渗出，同时增加身体排除患部毒素和废物的能力。DMSO可以使需要几周才能复原的伤势，缩减为几天。
　　2。抗菌
　　DMSO并不是高效的全能消毒剂，但它有中度的抗菌效果。35的DMSO溶液可抑制广泛的细菌和真菌（fungi）生长。它也会使某些病菌对抗生素更加敏感。曾经有一项研究显示，5的DMSO溶液可以使肺结核杆菌对链霉素（streptomycin，肺结核药）的敏感性增加200倍。
　　3。利尿
　　从皮肤着手，DMSO只有轻微的利尿效果；但适当的注射，就可以成为最强的利尿剂之一。在某些案例中，它增加了尿量10倍。DMSO对水的强亲和力把过量的液体摄入到血液里，然后经由肾脏过滤排出。严重的头部和脊髓受伤会引起脑水肿和脑细胞肿胀，造成颅内压力增加和永久性神经受损；DMSO作为脱水剂、利尿剂可能就是这类患者的救星。