类器官如何构建一个类器官

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　　提起类器官，大家的第一反应也许是这样的：在培养皿中，一个小小的器官悄然生长着……类器官（Organoid）是在体外用3D培养技术对干/祖细胞进行诱导分化形成的在结构和功能上都类似目标器官/组织的三维细胞复合体。类器官其具有稳定的表型和遗传学特征，能够在体外长期培养。
　　类器官是2017年度Nature Methods评选的方法, 细胞可来源于人体，结构类似于器官，则可以作为接近人体的研究模型, 进行科学研究和药物筛选。
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　　类器官：技术简介
　　2009年，荷兰 Hubrecht 研究所的Hans Clevers 团队成功在体外通过三维培养成体干细胞培育出拥有隐窝和绒毛结构的小肠细胞模型。这种体外三维（3D）培养成体干细胞或多能干细胞的技术被称之为＂类器官＂（Organoids）技术，因为所培养的组织类似物具有一定空间结构，并能模拟真实器官部分功能。
　　图1：肠类器官
　　与传统二维细胞培养相比，类器官是目前体外培养的细胞模型中最能够模拟体内组织结构及功能的技术，并且能够长期稳定传代培养。而且相比于动物模型，类器官操作更简单，更适用于高通量筛选及疾病发生和发展机理等研究。这一创新技术集中发展的十余年，已实现多种具有部分关键生理结构和功能的类组织器官的培养，比如：肾、肝、肺、肠、脑、前列腺、胰腺和视网膜等。因此，类器官技术在疾病建模、药物筛选、精准医疗、器官发育、再生医学等领域都有广泛的应用前景。
　　图2：类器官发展中关键技术突破时间一览表【1】
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　　类器官：发展前景
　　自Hans Clevers团队培养出小肠类器官后，短短十年，类器官相关的研究文章从2010年的42篇跃升至2020年的2097篇，成为研究热点。因此，类器官被《科学》杂志评为2013年度十大技术，在2018年初再次被《自然·方法》评为2017年度方法，2019年更是再次登上了《科学》杂志的特刊封面，以及持续成为各大顶级期刊杂志的热门主题。
　　2021年初，＂基于类器官的恶性肿瘤疾病模型＂在科技部下发的《关于对＂十四五＂国家重点研发计划6个重点专项2021年度项目申报指南征求意见的通知》中被列为首批启动的＂十四五＂国家重点研发专项任务。＂十四五＂国家重点研发计划指出，类器官是一项重大的技术突破，用于疾病模型的建立，还可用于研究病理状态下干细胞变异、异质性及其发生机理，挖掘疾病诊疗的新靶标和探索诊疗新策略。从类器官技术逐渐被各大顶级期刊报道到科技部下发的文件，我们可以看到类器官技术在未来将有非常大的应用价值和发展前景。
　　图3：2021年科技部下发＂十四五＂国家重点研发计划通知
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　　如何构建类器官模型
　　目前类器官可以分为两大类：组织细胞来源类器官（如肿瘤类器官）和多能干细胞来源类器官（如视网膜类器官、脑类器官）。
　　图4：肿瘤胶质母细胞瘤类器官 图5：脑类器官
　　类器官的构建是一项系统工程，需要物质基础和特定的培养环境。类器官构建的物质基础一般包括：3D支架、含有各种生长因子的培养基及和诱导添加物以及干细胞、支持细胞或组织等；而特定的培养环境包括了调控氧气、温度、二氧化碳、甚至包括一些力学等模拟体内细胞生长环境的参数。
　　类器官的培养过程是一个精准调控细胞生长微环境的过程，根据提供个性化的培养条件来模拟细胞在体内的微环境。3D支架给细胞的生长与细胞类别的自我组织及空间结构构建提供支撑，在细胞团的作用下，因为不同细胞会分泌不同的细胞粘附因子，不同类型的细胞会运动到3D支架的不同位置，实现了细胞类型的分离。由于空间的限制形成了＂谱系定向＂，也就是＂空间限制引起的细胞命运决定＂。而相应的培养基及诱导物激活或者抑制参与类器官形成的特定信号通路与稳态的维持。因此，在空间约束作用以及原来细胞分泌物或添加的诱导物的刺激等，这些细胞被进一步的分化，最终形成类器官。
　　图6：不同类器官制备方法【2】
　　类器官的经典制备路线是，将分离出的干细胞培养在3D支架(如基质胶Matrigel)上，铺在培养皿或培养孔板中，并添加包括FGF、EGF等在内的各类生长因子促进类器官形成。
　　而类器官技术发展至今，已衍生出多种培养模式，因为制备不同的类器官需要不同的特定环境、使用不同的添加物组合、诱导物添加的策略和不同的细胞起始状态，如图6所示。
　　不同的特定物理环境，可以包括采用天然细胞外基质（ECM，如类小肠器官或类胃器官）或合成高分子（如类小肠器官）的3D支架进行静态培养、采用无细胞外基质支架支撑（如类脑器官）或含细胞外基质蛋白（如类视网膜器官）的3D悬浮搅拌式培养、或者是采用气-液界面细胞团培养（如类肾器官）。
　　不同诱导物添加策略，包括全内源性诱导自主装（如类视网膜器官）、外源诱导分化-内源自组织（如类肾器官）或全外源诱导自主装（如类胃器官）。
　　起始细胞状态，可以选择单细胞（如类小肠器官）、均质的细胞团（如类视网膜器官）或多细胞类型的细胞团（如类肝细胞）。
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　　结束语
　　相信，随着研究的不断深入和技术的不断革新, 类器官作为一种理想的模型在人类健康的各个研究应用领域中将会扮演越来越重要的角色。
　　而针对不同组织器官来源的类器官，培养条件差异之大，需要经过基于不同实验条件的摸索，才能够成功培育出类器官。快速筛选合适的环境、诱导策略和细胞起始状态将会是缩短类器官研发过程的关键，加速类器官技术的开发。
　　目前，越来越多的研究者，也在类器官的培养方式上开始了新的探索。不再局限于平面静态的培养方式，而是通过搅拌瓶等能够提供动态剪切力的培养方式，这对类器官技术的研究发展，具有深远的影响。
　　参考文献：
　　[1] Corrò, C., Novellasdemunt, L., & Li, V. S. W. (2020). A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology.
　　[2] Rossi, G., Manfrin, A., & Lutolf, M. P. (2018). Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics.
　　《自然 · 综述》：T细胞在衰老中的角色
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