大鼠脊髓缺血再灌注后早期脊髓内促炎因子及抗炎因子的体现

　　脊髓缺血再灌注损伤(Spinal cord ischemiareperfusion injury，SCII)是脊柱手术及胸腹主动脉手术的灾难性并发症，其发生机制目前仍未明了，学者们提出了许多学说如：炎症反应、氧自由基介导的脂质过氧化作用、Ca2+ 超载、兴奋性氨基酸的毒性作用、细胞凋亡及相关基因表达、血-脑脊髓屏障通透性改变等。其中炎症反应参与脊髓缺血再灌注后的继发损伤机制受到了广泛的关注。本实验采用大鼠脊髓缺血再灌注模型，动态观察大鼠脊髓组织内炎性因子TNF-、IL-6、IL-4、IL-10的在脊髓组织内的表达，探讨促炎因子及抗炎因子的变化规律及其在脊髓缺血再灌注损伤中的作用。
　　材料与方法
　　1 动物分组及模型建立
　　120只健康成年SD大鼠(由西安交通大学实验动物中心提供)，雄雌不限，体重200 250g，随机分为假手术组(A 组)、缺血30min(B组)、缺血45min(C组)及缺血60min(D组)，每组均为30只。各组再分为造模后2、4、8、16、24h共5个时相组(亚组)，每个时相6只。用10%的水合氯醛(0.4ml/100g)腹腔注射麻醉，麻醉后腹部、背部剪毛，将大鼠仰卧固定于手术台上，加热垫维持直肠体温在37 38 。对B、C及D组大鼠参照Zivin法[1]建立SCII动物模型，常规消毒，采用腹部正中切口，仔细分离暴露腹主动脉至肾动脉水平，于左肾动脉起点下方约0.5cm处用无创动脉夹夹闭腹主动脉，并证实远端动脉搏动消失，以上各组分别夹闭30 min、45min及60min后开放，制作脊髓缺血再灌注损伤模型，假手术组除不夹闭腹主动脉外所有操作相同。每组在2、4、8、16、24h各时相点分别采用改良Tarlov评分评估大鼠后肢运动功能后立即处死动物，取L2 L5节段脊髓，重80 100mg，剥离脊髓组织外膜，-80 冻存备用。
　　2 检测指标及方法
　　①后肢运动功能观察：评分采用改良Tarlov评分标准：下肢无运动，不能负重为0分;下肢有可观察到的运动，但不能负重为1分;后肢活动频繁或有力，不能负重为2分;下肢可承受体重，能走1 2步为3分;可行走，仅有轻度障碍为4;行走正常为5分。②脊髓组织内促炎因子及抗炎因子检测：将冻存的脊髓组织解冻、匀浆，分别采用大鼠TNF-、IL-6、IL-4、IL-10酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(美国R﹠D公司分装)，按说明书步骤进行操作。
　　3 统计学方法
　　应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料采用珚xs 表示，多因素方差分析进行组间比较，LSD-t检验进行方差分析后的两两比较;组内比较以及亚组内比较采用单因素方差分析;改良Tarlov评分各组间比较采用秩和检验，P0.05认为差异有统计学意义。结 果1 改良Tarlov评分比较。在各个时间观察点，假手术组中的大部分动物后肢功能正常，各缺血组的动物后肢运动功能不同程度减退。后肢运动功能障碍严重程度：缺血60min组缺血45min组 缺血30min组假手术组(P0.05)。
　　讨 论
　　中枢神经系统(CNS)的神经元对缺血缺氧因素极其敏感，缺血30min脊髓组织就会出现明显的病理变化，即使短时间内血流恢复，其病理变化在原缺血损伤的基础进一步加重，甚至出现迟发性瘫痪。实验结果显示，在缺血再灌注2hTNF-、IL-6即有明显的表达，并随灌注时间逐渐上升，8h时达到高峰，随后逐渐下降。脊髓缺血再灌注后早期TNF-的大量表达并作为一种重要的炎症介质参与脊髓炎症反应的发生，同时TNF-可上调其它细胞因子IL-1、IL-6等的产生，TNF-可能是众多细胞因子的重要启动因子。NF-B可被缺血、缺氧等因素激活，并可在转录水平上调TNF-、IL-1、IL-6的表达，TNF-、IL-1及IL-6等细胞因子活化后可增强NF-B的表达形成一个正反馈机制，产生级联放大效应，形成恶性循环。此外，NF-B的激活可导致大量细胞粘附分子的释放，NF-B的信号通路与细胞凋亡密切相关，而这些均参与脊髓缺血再灌注损伤发生机制。创伤、缺血及感染等因素可激活CNS中的巨噬细胞、小胶质细胞及神经元等细胞并由这些细胞分泌TNF-、IL-6及其它炎性因子。TNF-及IL-6作为炎症反应的信号分子，其水平往往反应炎症反应的程度，而炎症反应与组织损伤密切相关。于是我们认为缺血再灌注后8h内是脊髓里炎症反应逐渐加剧的阶段，在这个时间段内神经组织遭受的损害比较严重。缺血时间延长，各时相点的促炎因子及抗炎因子表达量越高，即炎症反应程度约严重，缺血缺氧是脊髓缺血再灌注后脊髓炎症反应程度的决定性因素，TNF-和IL-6可敏感反应脊髓组织损伤的严重程度。
　　IL-10是一个典型的抗炎因子，主要由巨噬细胞和单核细胞产生，同时也是一种有效的单核细胞/巨噬细胞减活化剂，减少单核细胞/巨噬细胞对促炎细胞的合成。在炎症过程中，IL-10 抑制促炎因子IL-6、TNF-以及COX-2的作用产物前列腺素的分泌。另外，还可通过激活巨噬细胞并减少星形胶质细胞的激活，抑制细胞免疫和抑制TNF-、IL-6等促炎因子的合成和释放，下调组织损伤引起的继发炎症反应和细胞因子表达，在脊髓缺血再灌注后早期发挥关键的作用。IL-4是一种属于白介素家族的免疫介质，是参与体液免疫最重要的因子之一，主要调节Th淋巴细胞向Th2方向分化及提高细胞活性。在其它领域的研究中发现，IL-4与IL-10同样具有免疫调节及抗炎作用，并且IL-4及IL-10具有协同作用，在血液诱导的软骨损伤实验中联合应用IL-4及IL-10比单独应用IL-10更好的抑制促炎因子IL-1 和TNF- 的表达。我们的研究发现脊髓缺血再灌注后IL-4的表达变化与IL-10相似，这表明IL-4是脊髓缺血再灌注后脊髓内的炎症反应中同样是一个重要的炎性因子并在脊髓损伤的病理生理过程发挥重要的作用。
　　本研究发现，脊髓缺血再灌注后引起促炎因子TNF-、IL-6在再灌注2h即有明显的升高，抗炎因子IL-10在再灌注2h同样有明显的升高，IL-4在再灌注4h开始有明显的升高，且促炎因子及抗炎因子具有相似的变化规律。促炎因子升高，随后诱发抗炎因子迅速的上升，抗炎因子抑制促炎因子，使其下降，随后抗炎因子也随之下降。Van Meegeren等认为，在脊髓损伤里存在一个促炎因子/因素与抗炎因子/因素之间的相互平衡的网络。本研究发现，在脊髓缺血组动物的脊髓组织里，促炎因子TNF-和IL-6与抗炎因子IL-4和IL-10呈正相关，且脊髓缺血时间越长，炎性因子的表达量越高，于是我们认为，TNF-、IL-6、IL-4及IL-10均参与脊髓缺血再灌注后的炎症反应，且与脊髓组织的损伤程度密切相关。促炎因子与抗炎因子之间存在一个直接或间接的相互平衡关系，脊髓缺血再灌注后损伤后的炎症反应是一个自身调节和自我修复的过程。
　　脊髓损伤后的炎症反应是一把双刃剑，它同时具有细胞毒性和细胞保护的双重作用。适当的炎症反应可以清除损伤因子、组织碎片并可分泌各种神经营养因子，甚至对于脊髓组织的修复是必需的，但过度的炎症反应可引起重要组织结构与功能的损害，对于不可再生的中枢神经系统来说是毁灭性的。因此，如何利用这把双刃剑使其既要充分发挥其细胞保护作用的一面同时给予适当的干预使其尽可能避免细胞毒性作用是我们继续努力探索的方向。本研究明确了SCII后早期脊髓组织内炎性因子自身变化情况，但没有观察到炎性因子表达水平恢复至正常水平，这与实验设计的观察时间过短有关。另外，通过抑制炎性因子的表达来防治脊髓缺血再灌注损伤尚待进一步研究。