谈靶向肿瘤干细胞天然药物的研究进展

　　肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)是肿瘤组织中存在的极小部分细胞，通常处于静止状态，当受到细胞因子等影响时会导致肿瘤的发生、转移和复发，这均源于CSC 拥有很强的自我更新及增殖分化的能力。关于CSC 的来源目前仍存在诸多争议，然而科学家们已相继在多种肿瘤组织中分离得到CSC，比如乳腺、肝脏、结肠、大脑、头颈、胰腺、卵巢及白血病等。随着手术、化疗、放疗等多种有效疗法的应用，以及疾病的早期筛查，癌症患者的存活率虽有所提高，但仍有50%的患者会遭遇病情复发，而化疗药物的应用也会极大程度地富集CSC。因此更多的学者认为彻底治愈肿瘤的有效疗法除针对肿瘤组织中的大部分肿瘤细胞， 更重要的是靶向其中的肿瘤干细胞，由此引发靶向干细胞的药物研究成为肿瘤研究领域的热点。研究发现许多中药、天然药物的有效成分对CSC 有明显的作用，能有效提高CSC 的化疗敏感性，靶向肿瘤发生等过程的分子信号通路，为肿瘤的药物治疗提供了新的途径。本文对近年来靶向肿瘤干细胞的中药及天然药物进行了总结与分析。
　　1 小白菊内酯(parthenolide，PTL)
　　由菊科植物艾菊中分离纯化出的倍半萜内酯化合物PTL 能够成为最近的研究热点，得益于其抗肿瘤活性、DNA 抑制及促使肿瘤细胞对抗癌药物产生致敏能力等作用。作为核转录因子-B(nuclear factor-B，NF-B)的有效抑制剂，PTL 已被证实可诱导人急性髓细胞性白血病(acute myelocytic leukemia，AML) 干细胞的凋亡并对正常血液细胞无任何损伤效应， 是治疗白血病的潜在药物。研究发现，PTL能够靶向抑制鼻咽癌侧群细胞并下调增强CSC 特性的环氧酶(cyclooxygenase-2，COX-2)， 通过抑制B 抑制因子(inhibitor B，IB)激酶复合体(IB kinase，IKK) 的磷酸化作用和IB 的降解来发挥抗肿瘤干细胞样细胞的作用。PTL 在非小细胞肺癌肿瘤干细胞样细胞中引起强烈的内质网应激反应而诱导其凋亡，与放射性化疗协同作用使骨肉瘤CSC显著减少。Gunn 等利用在细胞外基质生长细胞的三维组织培养体系模拟重建人骨髓， 将细胞外基质对药物的耐受作用和对肿瘤细胞的保护作用考虑进去，证实了PTL 是抗多发性骨髓瘤干细胞的有效天然药物， 与非CSC 相比，PTL 对CSC 有更强的毒性作用。尽管PTL 是抗CSC 的新型化合物，其极低的水溶性却限制了它的临床应用， 体内代谢也会进一步降低PTL 的治疗效果。在上述模拟条件下，该研究组发现，与非致瘤性肿瘤细胞相比，PTL 氟化物对多发性骨髓瘤干细胞有更强的抑制作用， 而PTL氯化物的作用则相反。此外，PTL 二甲氨基类似物可有效改善PTL 的水溶性及生物利用度，已成功地用于消除AML 干细胞。Long 等用木香烃内酯半合成得到60%收率的PTL 环丙基类似物在酸性环境及血浆中的稳定性极强，将其分别作用于白血病细胞、CD34+白血病始祖细胞及CD34+CD38-白血病干细胞，细胞存活率分别为15.3%、9.2%、6.0%，说明PTL环丙基类似物能够选择性消除AML 始祖/干细胞。PTL 的低渗透性限制了其进入肿瘤细胞、进入血液循环而发挥作用， 若进一步研究提高其渗透性的衍生物，则能发挥更大的作用。
　　2 姜黄素(curcumin)
　　姜黄素是姜黄植物根茎的有效成分， 作为传统食疗剂，具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗肿瘤等活性，不断有研究证明姜黄素可以通过靶向CSC 来发挥抗肿瘤活性。Marquardt 等[8]发现姜黄素通过靶向抑制NF-B 通路选择性抑制肝癌干细胞，肝癌干细胞的消除能力与NF-B 抑制程度直接相关。基因表达分析显示姜黄素在一定程度上是通过抑制NF-B信号通路引起组蛋白去乙酰化酶的抑制来发挥肝癌干细胞消除能力的。在乳腺癌的研究中，有报道发现姜黄素与表没食子儿茶素没食子酸酯合用可特异性抑制STAT3 磷酸化、维持STAT3-NFB 的相互作用从而抑制乳腺癌CSC， 通过增强E 钙黏蛋白/-catenin 的负反馈环抑制乳腺癌CSC。在神经胶质瘤中， 姜黄素能抑制胶质瘤干细胞样细胞的肿瘤球形成能力，通过促进自噬从而促进胶质瘤始祖细胞的分化。除此之外，姜黄素还可抑制食管癌干细胞、头颈癌肿瘤干细胞的形成。研究者发现姜黄素与FOLFOX 化疗方案合用或单用姜黄素可显著减少结直肠癌肝转移CSC 的肿瘤球数目及乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)高活性细胞。在部分外植体中，姜黄素与奥沙利铂、氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)三者连用有显著的增殖抑制及促凋亡作用， 同时减少了干细胞标志蛋白ALDH、CD133的表达。第一阶段临床剂量递增试验证明了姜黄素的安全性，作为FOLFOX 辅药每日剂量可达2g。
　　上述研究均表明姜黄素是治疗多种肿瘤的潜在药物，然而姜黄素具有水溶性极低、体内吸收少、代谢快、生物利用度不高的特点，开发合成姜黄素修饰物是改善其生物利用度的最佳选择。研究发现FOLFOX 化疗方案联合姜黄素二氟化物(difluorinatedcurcumin，CDF) 比联合姜黄素能更有效地消除结肠癌干细胞，伴随CD44+CD166+细胞减少、生长抑制、克隆球裂解，以及通过诱导CSC 凋亡更有效地抑制肿瘤形成能力。进一步的分子研究表明CDF 联合FOLFOX 诱导消除CSC 与一些重要的信号通路EGFR、IGF-1R、NF-B 的衰减及其下游通路WNT/-catenin、COX-2 和c-Myc 的抑制有关， 且CSC 的凋亡与Bax/Bcl-XL 增大相关。Bao 等认为CDF 可抑制因低氧诱导因子引起的VEGF、IL-6 升高，前列腺癌/胰腺癌CSC 标记基因Nanog、Oct4、EZH2 及致癌miR-21 的高表达。Basak 等证明CDF 脂质体在体内外对头颈癌CSC 有显著抑制作用。Wei 等发现胆甾醇基透明质酸姜黄素类似物能够显著增强姜黄素靶向消除CD44+乳腺癌干细胞的能力。可见，姜黄素及其类似物作用于CSC 的机制多样，但以上结果大多局限于体外研究， 并且姜黄素的副作用及DNA 损害都将限制其临床运用，有研究报道姜黄素能促进DCLK1+结肠癌干细胞的生存，严重干扰了其抗肿瘤作用， 运用RNA 干扰技术沉默DCLK1 标志蛋白后发现， 姜黄素显著促进体内外结肠癌细胞的凋亡。就目前的研究状况观察，姜黄素对多种肿瘤和肿瘤干细胞都有明确的靶向作用， 如何将姜黄素有效地应用于临床还需进行更深刻的体内研究设计及临床研究。
　　3 紫花牡荆素(casticin，CAS)
　　由马鞭草科植物的干燥成熟果实蔓荆子提取的紫花牡荆素是一种多甲氧基黄酮类化合物， 和多种黄酮类化合物一样， 紫花牡荆素也是抗肿瘤的天然药物成分。Feng 等通过高通量筛选发现CAS 抑制胶质瘤干细胞的肿瘤球形成能力。研究人员用无血清悬浮培养法在非小细胞肺癌A549 细胞系中富集具有自我更新及高侵袭能力，体内具有高致瘤性，以及干细胞标志分子CD133、CD44、ALDH1 高表达的肺癌干细胞样细胞，发现CAS 对该干细胞样细胞有抑制增殖的作用， 且抑制作用远强于对A549 细胞系的作用。除此，CAS 能够抑制肺癌干细胞样细胞的自我更新和侵袭能力， 并伴随CD133、CD44、ALDH1 蛋白表达的降低及MMP-9 活性的减弱。进一步研究表明，CAS 一定程度上可通过抑制AKT 磷酸化作用来抑制肺癌干细胞样细胞。He 等在MHCC97 肝癌细胞系中分离到肝癌干细胞， 发现CAS 同样对肝癌干细胞有显著的增殖抑制作用，可降低肝癌干细胞球形成能力，下调-catenin 蛋白表达。该研究组认为分离于SMMC-7721 肝癌细胞系的CD133+细胞，不仅在体外具有较强肿瘤球形成能力，在Balb/c-nu 裸鼠中也有高致瘤性，因此CD133+细胞具有肝癌干细胞样特性。实验发现CAS 可增加E 钙黏蛋白的表达并降低N 钙黏蛋白表达，作用于肝癌干细胞48h 后也降低了上皮间质转化相关的转录因子Twist， 而Twist 蛋白的过表达能够减弱CAS诱导的E/N 钙黏蛋白的表达变化并减弱肝癌干细胞的上皮间质转化抑制。因此认为CAS 是通过下调Twist 蛋白抑制上皮间质转化从而靶向肝癌干细胞的。
　　4 白藜芦醇(resveratrol，Res)
　　白藜芦醇是多酚类化合物，在葡萄、虎杖等植物中含量丰富，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、保护心血管、肝脏、美容减肥等多种生物学活性，其抗肿瘤作用是近年研究的热点。Yang 等[25]用无血清培养法从人结肠癌HCT116 中分离到CD133、CD44 高表达的结肠癌CSC， 进一步研究发现，Res 能显著抑制该CSC 的增殖且呈时间和剂量依赖性， 使处于G0/G1阶段的细胞增多， 凋亡也相对增加;Res 还能上调CSC 组织相容性抗原的表达并增强其免疫原性。Sayd 等发现Res 浓度在150mol/L 前都能够抑制胶质瘤干细胞增殖，当剂量更高时会诱导其坏死，但对正常神经干细胞却无影响。进一步的Westernblot 检测发现依赖NAD + 的去乙酰化酶sirtuins(NAD-dependent deacetylases sirtuins，SIRT) 中的SIRT1 和SIRT3 均存在于胶质瘤干细胞及正常神经干细胞，SIRT2 在胶质瘤干细胞中的表达则受限。通过小分子RNA 干涉使SIRT2 表达下调能够抵消Res 对CSC 增殖的抑制作用， 并不能抵消高剂量Res 引起的CSC 坏死， 因此认为Res 可能通过SIRT2 对胶质瘤干细胞产生增殖抑制。黑素细胞刺激素(-melanocyte-stimulating hormone，-MSH)是已知的产生黑色素的主要途径， 这一通路被证实与CSC 特性相关，Chen 等发现Res 能够增强STI571抑制黑素瘤细胞中-MSH 通路的作用，并抑制黑素瘤细胞的生存能力和侵袭能力， 预示Res 可能具有作用于黑素瘤CSC 的潜力。miR-145 和miR-200c 在鼻咽癌CSC 中表达下调，有学者证实Res 通过激活p53 诱导miR-145 和miR-200c 并抑制鼻咽癌CSC 的干性、上皮间质转化及代谢重编程，若在Res激活p53 的分子机制上作进一步研究很可能找到靶向鼻咽癌CSC 的新疗法。人早幼粒细胞白血病KG-1a 细胞与白血病CSC 的特性极为相似，对化疗药物耐受并对细胞毒细胞弱敏，而25mol/L 的Res 能够抑制50%KG-1a 细胞生长， 这是通过NKG2D 配体和TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand)受体使KG-1a 细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞所介导的细胞溶解敏感性增强而实现的。还有研究证实Res 能够抑制人和KrasG12D 转基因胰腺癌小鼠的胰腺癌CSC。Res 对包括乳腺癌在内的多种肿__瘤干细胞的抑制作用也均有报道， 可见从靶向肿瘤干细胞方向研究Res 的抗肿瘤作用极具开发价值。
　　5 萝卜硫素(sulforaphane，SFN)
　　萝卜硫素，又称莱菔硫烷，在西兰花、芥蓝等十字花科植物中含量丰富， 可以造成癌细胞的细胞凋亡和细胞阻滞，是一种新型的抗癌活性成分，已成为癌症新药研发领域的热点。胰腺癌研究中，有报道SFN 能显著增加顺铂、吉西他滨等化疗药物对胰腺癌及前列腺癌的细胞毒性作用，并且CSC 的克隆形成、球形成能力，ALDH1、Notch1 和c-Rel 的表达均受到显著抑制，CSC 移植瘤的生长也明显被抑制，因此SFN 可增强常用化疗药靶向抑制CSC 的作用。Forster 等发现连接蛋白Cx43 在非侵袭性及有细胞间隙连接能力的细胞表面表达，而在高恶性、E 钙黏蛋白缺失及无细胞间隙连接能力的细胞表面无表达。但SFN 能够增加Cx43 和E 钙黏蛋白的表达水平，改善细胞间隙连接并抑制胰腺癌CSC 表面标记分子c-Met 和CD133 的表达。也有研究表明SFN体外可抑制胰腺癌CSC 的自我更新，将从人胰腺癌肿瘤组织中分离出的CSC 植入NOD/SCID 鼠的胰腺，SFN 通过下调SHH 通路的Smo、Gli1、Gli2 显著抑制肿瘤生长。Labsch 等富集了晚期前列腺癌DU145 和PC3 细胞系及人源前列腺癌CSC，并通过球形成实验、克隆形成实验、流式细胞术和Westernblot 实验检测SFN 和重组可溶性TRAIL 对该细胞的NF-B 活性、自我更新能力、分化潜能及干细胞信号通路的影响， 发现SFN 和TRAIL 在抑制CSC上有协同作用， 且与TRAIL 相比，SFN 对CSC 的影响更大，有更明显的抗肿瘤作用。也有研究发现乳腺基底样导管原位癌中有CSC 样细胞，并鉴定其为具有ALDH1 活性的CD49f+/CD24-干细胞样细胞，与非CSC 相比， 这些细胞表现出较强的迁移能力，而SFN 能够靶向该CSC 样细胞，减少ALDH1 的表达，降低球形成及克隆形成能力。
　　6 大豆异黄酮(isoflavone)
　　大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类具有生物活性的次级代谢产物，广泛存在于豆类、谷类、水果等植物中，在抗癌防癌研究中，大豆异黄酮是公认的首选物质，其中染料木黄酮(genistein，GEN)为其最有效的活性成分，有抗多种肿瘤的作用，尤其针对乳腺癌和前列腺癌。Fan 等采用微球形成实验证明GEN 能够减少乳腺癌微球体的数量并降低其大小， 在体内实验中， 该研究组以表面分子ALDH为指标，通过免疫组化及RT-PCR 实验发现GEN 能够显著降低ALDH 的染色、mRNA 及蛋白的表达。进一步的机制研究表明，GEN 可通过抑制Hedgehog-Gli1 通路从而抑制乳腺癌CSC。Yu 等从胃癌MKN45 细胞中分离到CD44+胃癌肿瘤干细胞样细胞， 与CD44-胃癌细胞相比，SHH 信号通路基因在CD44+细胞中表达较多。GEN 作用于CD44+细胞后，Gli1、CD44 的mRNA 及蛋白表达均显著降低， 其他干细胞标记分子的表达也有降低，除此之外，CD44+细胞的迁移能力也受到GEN 的阻止。总之，GEN 可能通过抑制Gli1 基因的表达抑制胃癌肿瘤干细胞。Huang 等在胃癌研究中，发现GEN 能够抑制胃癌CSC 的克隆形成能力、肿瘤球形成能力及CSC 表面标记分子的表达， 其增强胃癌细胞耐药性的作用可能与抑制ERK1/2 的活性有关。目前，关于天然化合物GEN 还未有不良反应的相关报道，GEN 或许能够提供一种全新的、安全有效的治疗肿瘤的思路。除上述天然活性成分外，白杨素、水飞蓟素、穿心莲内酯、槲皮素、熊果酸等都具有靶向抑制CSC的作用。有研究发现8-溴-7-甲氧基白杨素可通过下调肝癌干细胞中Twist 和-catenin 的表达抑制肝癌干细胞的上皮间质转化和表面标志CD133、CD44的表达，从而抑制肝癌干细胞的侵袭性、自我更新和增殖分化能力;水飞蓟素可阻止致癌信号通路尤其是IL-4/-6 来抑制结肠癌CSC，通过影响PP2A/AKT/mTOR 通路抑制结直肠癌CSC，并可阻止ZEB1的表达，抑制膀胱癌CSC，与EGFR TKIs 合用可靶向抑制EGFR 基因突变的非小细胞肺癌CSC， 并削弱其躲避死亡的能力。此外，有报道槲皮素和萝卜硫素可协同抑制胰腺癌CSC 的自我更新。
　　放眼整个中医药宝库， 上述若干天然药物只是冰山一角， 更多的具有抗肿瘤效应的天然药物单体仍不断地被发现， 而抗肿瘤作用的机制也是不尽相同。目前关于各天然药物的抗肿瘤机制虽不甚明朗，但通过科学家们的潜心研究可以预见天然药物作为抗肿瘤药物的美好前景。