超分子水凝胶作为胰岛素缓释体系的分析

　　超分子水凝胶是通过物理交联作用得到的聚合物三维网状空间结构，它含水量高，生物相容性好，是最具应用前景的可注射生物材料之一，近来广泛应用于药物释放和组织工程领域.
　　超分子水凝胶体系由较弱的非共价作用交联，在剪切作用下这种物理交联可被破坏，使水凝胶黏度降低，静置后其黏度可恢复，具有可逆的溶胶-凝胶转变行为. 这种触变性质使超分子水凝胶载药后可通过注射植入体内病灶处，在体液稀释作用下逐渐溶解释放药物，达到缓释药物的目的.这类水凝胶还可以很好地稳定水溶性药物，尤其是减少多肽类药物的酶解，常被用于水溶性药物的缓释体系研究.
　　-环糊精( -CD) 是由糖苷键连接的环状六聚糖，可选择性穿在线形聚乙二醇( PEG) 链上形成超分子包合物并排列堆积得到不水溶的微晶区. 当PEG 分子量较低时，完全包合的超分子包合物形成白色沉淀. 但当PEG 分子量较高或聚合物中还有其他水溶性链段时，所得不完全包合物则可形成超分子水凝胶. 已报道的高分子量PEG、接枝PEG、星状PEG和含有PEG 链段的嵌段聚合物，均可与-CD 形成超分子水凝胶. Ma 等报道了以含有PEG 的聚合物胶束和-CD 包合制备的水凝胶用于生物活性溶解酵素的负载. Hashim 等报道了PEG 均聚物和CD 形成的水凝胶用于胰岛素的负载. 表明这类超分子水凝胶能稳定负载多肽类分子并保持其生物活性.
　　胰岛素制剂皮下注射是目前用于糖尿病治疗的主要手段，相比于口服胰岛素药物( 尚处于研究阶段) ，皮下注射给药具有更快的降血糖效果和更高的药物利用度，但由于药物释放较快，需要频繁注射给药，增加了病人的身体和心理负担. 探索胰岛素长效缓释体系，是减少胰岛素注射频率的有效方法. Huynh 等报道了pH/温敏性五嵌段聚合物凝胶负载胰岛素，对小鼠的血糖控制时间长达15 天. Peng 等报道了负载胰岛素/聚合物粒子的壳聚糖凝胶，可在5 天内控制小鼠血糖稳定. Wang 等报道了Pluronic F127温敏水凝胶用于胰岛素缓释，可在48 h 内持续释药.
　　本 文研究了含有PEG 链段的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物( Pluronic F127PEG-b-PPG-b-PEG) 与-CD 形成的超分子水凝胶( Pluronic F127 /-CD) 对胰岛素的负载和释放行为. 凝胶结构如图1 所示，与PEG 均聚物/-CD超分子水凝胶体系类似，Pluronic F127 /-CD水凝胶体系通过PEG 链与-CD 形成的超分子包合物并排列堆积得到微晶区交联点. 此外，Pluronic F127 还含有疏水链段PPG，可通过疏水作用聚集形成另一种物理交联点. 虽然PluronicF127 水溶液在一定浓度和温度下即可形成水凝胶，但其固含量较高，如与-CD 形成超分子体系，则可大大降低凝胶体系的固含量，有利于释药后载体的代谢排出. 胰岛素负载于水凝胶的亲水网络中，通过扩散缓慢释放. 该超分子水凝胶对于亲水性小分子药物和多肽类药物的负载
　　释放具有普适性.
　　1 实验部分
　　1. 1 试剂与仪器
　　Pluronic F127( PEG125-b-PPG40-b-PEG125) 购于Aldrich，其分子量为13400，分散度为1. 02，PEG质量分数为82. 5 wt%. PEG( 两端基分别为甲氧基和羟基，分子量为2000) 购于Alfa. -CD 购于Wacker Chemie AG. NaH2PO42H2O 购于西陇化工股份有限公司，Na2HPO412H2O 购于北京化工厂，用其配制的缓冲溶液( PBS) 浓度为0. 01mol /L，pH 值为7. 4. 胰岛素( 猪源，28 U/mg) 购自徐州万邦金桥制药有限公司. 盐酸配成0. 1mol /L 水溶液待用. 噻唑蓝( MTT，荷兰Duchefa公司生产) ，透析袋( 截流分子量为14000) 和其他试剂直接使用.
　　ZHWY-103B 型恒温摇床( 上海智诚分析仪器制造有限公司) ; UV-1601 型紫外-可见分光光度计( 日本岛津公司) ; D/max 2500X 型X-射线电子衍射仪( 日本理学公司) ，Cu 靶激光( 40 kV，40 mA) ，波长 = 0. 1541 nm，样品扫描步长为2 = 2( ) /min，扫描范围为5   35 JSM-6700F型扫描式电子显微镜( 日本电子公司) ;MULTISCAN MK-III 型酶标仪( 美国热电公司) ，检测波长为570 nm.
　　1. 2 超分子水凝胶的制备
　　制备载药超分子水凝胶的一般步骤为: 在室温下( 20   25  ) ，将聚合物Pluronic F127 溶于PBS 得到一定浓度的聚合物溶液. 将一定量的胰岛素( 需加入少量0. 1 mol /L 盐酸水溶液助溶) 与-CD 溶于PBS 得到胰岛素/CD 水溶液. 将上述两溶液混合后超声波震荡( 或超声波震荡后静置) 得到载药超分子水凝胶.
　　如需制备未载药水凝胶，则不加胰岛素及盐酸，其他制备步骤同上.
　　1. 3 载药超分子水凝胶形貌表征
　　载药超分子水凝胶的形貌通过扫描式电子显微镜( SEM) 来观察，先将扫描电镜样品台贴好导电胶，再将冷冻干燥后的水凝胶样品粉末贴到导电胶上，样品喷金30  40 s，然后在15 kV 加速电压下，用SEM 观察水凝胶的表面形态，并拍照.
　　1. 4 载药超分子水凝胶体外药物释放测试
　　载药超分子水凝胶的体外药物释放实验在PBS 中进行. 在1. 5 mL 离心管中制备0. 5 g 载药超分子水凝胶，用透析袋封口，完全浸入到装有80 mL PBS 的烧杯中，将烧杯置于37  恒温摇床中，以30 r /min 速度晃动. 一定间隔时间取烧杯中溶液3 mL，通过紫外-可见分光光度计检测胰岛素含量，检测波长为276 nm. 以释放出的药物百分比( %) 对时间( t) 作图.
　　1. 5 细胞毒性实验
　　将人肝癌BEL-7402 细胞在含有5% 青霉素-链霉素、10% 胎牛血清蛋白的RPMI 1640 灭菌培养液中培养，用细胞计数板计算细胞浓度后种植在96 孔板上，密度为3000 细胞每孔，置于5%CO2，37  的细胞培养箱中培养24 h. 将不同浓度的水凝胶( 未载药) 样品加入细胞板中，分别在细胞培养箱中培养24、48 和72 h 后，加入20 LMTT 溶液，再培养4 h，细胞生成蓝色MTT 结晶.加入0. 15 mL DMSO，震荡溶解MTT 结晶，使用酶标仪检测570 nm 处吸收强度. 以未加水凝胶的细胞组为参比( 认为细胞存活率为100%) ，计算各组细胞的存活率. 每组实验至少重复4 次.
　　1. 6 动物实验
　　雄性NIH 小鼠( 周龄5   6 周，来源广州动物所) 根据体重进行给药. 载药水凝胶给药剂量为40 U/kg，给药途径为皮下注射. 每个采血点3 只小鼠，采血点为5 min，15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，采集的血液置于冰上，分离血清冷冻保存待测. 使用胰岛素检测试剂盒的交叉反应情况，试剂盒质量，进行胰岛素的药代动力学( PK) 实验.
　　2 结果与讨论
　　2. 1 载药超分子水凝胶的制备和性质
　　为了优化凝胶组分，得到在较低的固含量条件下成胶的样品，我们首先考察了不同组分含量的载药水凝胶的凝胶化情况. 表1 列出PluronicF127 /-CD 载药水凝胶体系的组成和凝胶化结果. 体系中-CD 含量均为9. 7 wt%，胰岛素含量均为4 wt%. G1 样品中Pluronic F127 含量为7wt%，胰岛素负载量为4 wt%，-CD 和EG 单元的摩尔比[-CD]/[EG]是1  13，超声震荡5 min后变成白色不流动的水凝胶. 由于-CD 与PEG链段包合物结晶得到较大尺寸的微晶区交联点，对光有强散射作用，因此得到的超分子水凝胶呈现白色. 样品G2，G3，G4 的Pluronic F127 含量分别为6 wt%，5 wt%，4 wt%; [-CD]/[EG]分别为1  11，1  9，1  7. 在超声波震荡8 min 内均可形成水凝胶. G5，G6，G7 样品的Pluronic F127含量分别为3 wt%，2 wt%，1 wt%，虽然可以形成凝胶，但是其凝胶时间较长，需要超声波震荡10 min 以上或震荡后静置才能凝胶化. 而将Pluronic F127 含量降低到0. 5 wt% 时，样品G8在超声波震荡30 min 后静置仍不能形成水凝胶，这是由于聚合物含量过低，其中的PEG 链段与-CD 包合物微晶区过少，不能构成稳定的三维网络结构形成超分子水凝胶. 综合考虑凝胶固含量及凝胶化时间2 个因素，G4 体系具有较低的固含量和较短的凝胶时间，适于胰岛素缓释研究.通过X 射线衍射( XRD) 研究Pluronic F127 /-CD 水凝胶体系中PEG 链段与-CD 的包合作用.胰岛素的衍射曲线，没有明显的结晶峰出现.给出-CD 的衍射峰. 与此不同，PEG( Mn 2000) /-CD 包合物( 冻干粉末) 具有2 = 19. 4 ( d = 0. 457 nm) 的结晶峰. 样品G4( 冻干粉末) 在2 = 19. 4处出现结晶峰，与PEG/-CD 形成的包合物结晶峰一致，说明在上述水凝胶体系中-CD 穿到PEG 链段上并聚集结晶.样品G2-G5水凝胶冻干粉末的扫描电镜照片，均具有多孔结构，这是由水凝胶的高含水量造成. 本文其他水凝胶冻干粉末具有同样的形态. 需要说明的是，XRD和SEM 测试的样品为冻干粉末( 白色固体) ，而非胶态直接测试. 胶态样品亦为白色固体，这是由于在体系中存在较大尺寸的粒子( 如聚集胶束和包合物微晶区) 造成的光散射现象所致.
　　上述超分子水凝胶组成中的Pluronic F127是两亲性聚合物，在水溶液中形成以PPG 为核，PEG 为壳的胶束. -CD 穿入胶束外壳的PEG 链段，形成项链状包合物. 环糊精包合聚合物链的驱动力主要有疏水相互作用、范德华力、氢键相互作用以及尺寸选择等. 由于-CD 的内腔具有疏水性，在疏水相互作用力下含有疏水乙撑基单元的PEG 链会选择性地穿入-CD 内腔中，范德华力在该过程中也起到了协同作用. -CD内腔直径为0. 57 nm，对适配其空腔大小的PEG链作用力最强. 不同胶束的包合物聚集堆积形成物理交联点，得到超分子水凝胶. 该体系中有两种类型的物理交联点，其一为Pluronic F127胶束PPG 核，其二为胶束PEG 壳与-CD 包合物聚集堆积而成的微晶区. 该超分子水凝胶的制备过程中完全不使用有机溶剂，适于作为蛋白类药物载体，避免有机溶剂造成蛋白类药物变性. 我们将水溶性蛋白类药物胰岛素负载于水凝胶的亲水网络中.
　　2. 2 载药超分子水凝胶的体外药物释放
　　载药水凝胶G4 和G5 的体外药物释放实验在37  的PBS( 0. 01 mol /L，pH = 7. 4) 中进行.实验过程中，将水凝胶置于离心管中，用透析袋封口，浸入PBS 中释药. 释放出的胰岛素可穿过透析袋至外部PBS 中，通过紫外分光光度计监测PBS 中的胰岛素含量，绘制药物释放曲线. G4 前5 h 内胰岛素释放较快，释放量约为30%，而后约60 h 内，胰岛素持续并完全释放. 由于水凝胶外部直接接触PBS，凝胶溶解释放胰岛素，导致初期释放速度稍快，待形成稳定的释放体系后，则呈现缓慢持续释放趋势. 与已报道的PEG 均聚物/-CD 超分子凝胶相比，G4 对胰岛素的释放时间更长且释放更完全. 这表明Pluronic F127 /-CD 凝胶体系由于含有2 种交联点，比PEG 均聚物/-CD 凝胶体系的结构更稳定，溶解更慢，释药时间更长. 固含量更低的载药水凝胶G5 在前5 h 内胰岛素释放约38%，持续释放时间约57 h. G5 的暴释现象比G4 明显，总体释药时间相当. 可能因其固含量较G4低，导致前期凝胶溶解稍快，加快了初期胰岛素释放，而后的释放行为则与G4 类似. 相比而言，G4 暴释较少，更适合作为胰岛素载体.
　　2. 3 水凝胶的细胞生长抑制性
　　通过未载药水凝胶对人肝癌BEL-7402 细胞的作用结果，表征水凝胶材料的细胞生长抑制性.其他组分与G4 相同，但不含有胰岛素的水凝胶样品，与人肝癌BEL-7402 细胞共同培养不同时间后的细胞生长情况. 当凝胶体系混合物( Pluronic F127 和-CD 质量比为4  9. 7) 浓度为1750 mg /L 时，与细胞共培养24 h 后，细胞存活率为( 83 14) %，但共培养48 h 和72 h 后，细胞存活率仅为( 60 4) % 和( 49 2) %. 当凝胶体系混合物浓度降为438 mg /L 时，细胞存活率有所上升，但72 h 后仍不足80%. 当凝胶体系混合物浓度进一步下降至109 和27 mg /L 时，共培养24，48，72 h 后，细胞存活率均高于80%.结果表明，在适当的浓度下，如小于109 mg /L时，水凝胶组分对BEL-7402 细胞的生长没有明显抑制作用，具有生物相容性，可作为药物载体在生物体内使用.
　　2. 4 载药超分子水凝胶的体内药物释放
　　以雄性NIH 小鼠为对象研究载药水凝胶的药代动力学性质. 考虑到载药凝胶可能具有缓释效果，为确保血药浓度处于检测试剂盒的最佳测试范围，凝胶制剂组给药剂量为40 U/kg ( 有效胰岛素浓度) . 通过检测不同时间后小鼠的胰岛素血药浓度，研究水凝胶载体对胰岛素体内血药时间的影响. 图6 为注射负载胰岛素的水凝胶G4 后，小鼠体内的血药浓度曲线. 8 h 测得的血药浓度为1 g /L，峰值为46 g /L. 而注射胰岛素原药的小鼠血药浓度2 h 后就低于1 g /L 了.结果表明，负载胰岛素的超分子水凝胶制剂，对于延长胰岛素的作用时间有一定效果.
　　3 结论
　　利用-CD 和含有PEG 链段的两亲性嵌段聚合物Pluronic F127 构筑超分子水凝胶体系，用于胰岛素的负载和缓释研究. 该物理交联水凝胶的交联点包括-CD 与PEG 链包合物堆积形成的微晶区和聚合物疏水链段聚集区. 水凝胶的亲水网络可负载胰岛素等水溶性药物，体外释药曲线表明，胰岛素可在约65 h 内持续缓慢释放，前5 h释放速率稍快. 未载药水凝胶组分对细胞生长无明显抑制作用. 该水凝胶体系可延长胰岛素的体内作用时间，可作为亲水性药物，尤其是蛋白类药物的优选缓释体系.