超分子水凝胶作为胰岛素缓释体系的分析

　　超分子水凝胶是通过物理交联作用得到的聚合物三维网状空间结构，它含水量高，生物相容性好，是最具应用前景的可注射生物材料之一，近来广泛应用于药物释放和组织工程领域。
　　超分子水凝胶体系由较弱的非共价作用交联，在剪切作用下这种物理交联可被破坏，使水凝胶黏度降低，静置后其黏度可恢复，具有可逆的溶胶凝胶转变行为。这种触变性质使超分子水凝胶载药后可通过注射植入体内病灶处，在体液稀释作用下逐渐溶解释放药物，达到缓释药物的目的。这类水凝胶还可以很好地稳定水溶性药物，尤其是减少多肽类药物的酶解，常被用于水溶性药物的缓释体系研究。
　　环糊精（CD）是由糖苷键连接的环状六聚糖，可选择性穿在线形聚乙二醇（PEG）链上形成超分子包合物并排列堆积得到不水溶的微晶区。当PEG分子量较低时，完全包合的超分子包合物形成白色沉淀。但当PEG分子量较高或聚合物中还有其他水溶性链段时，所得不完全包合物则可形成超分子水凝胶。已报道的高分子量PEG、接枝PEG、星状PEG和含有PEG链段的嵌段聚合物，均可与CD形成超分子水凝胶。Ma等报道了以含有PEG的聚合物胶束和CD包合制备的水凝胶用于生物活性溶解酵素的负载。Hashim等报道了PEG均聚物和CD形成的水凝胶用于胰岛素的负载。表明这类超分子水凝胶能稳定负载多肽类分子并保持其生物活性。
　　胰岛素制剂皮下注射是目前用于糖尿病治疗的主要手段，相比于口服胰岛素药物（尚处于研究阶段），皮下注射给药具有更快的降血糖效果和更高的药物利用度，但由于药物释放较快，需要频繁注射给药，增加了病人的身体和心理负担。探索胰岛素长效缓释体系，是减少胰岛素注射频率的有效方法。Huynh等报道了pH温敏性五嵌段聚合物凝胶负载胰岛素，对小鼠的血糖控制时间长达15天。Peng等报道了负载胰岛素聚合物粒子的壳聚糖凝胶，可在5天内控制小鼠血糖稳定。Wang等报道了PluronicF127温敏水凝胶用于胰岛素缓释，可在48h内持续释药。
　　本文研究了含有PEG链段的聚乙二醇聚丙二醇聚乙二醇三嵌段共聚物（PluronicF127PEGbPPGbPEG）与CD形成的超分子水凝胶（PluronicF127CD）对胰岛素的负载和释放行为。凝胶结构如图1所示，与PEG均聚物CD超分子水凝胶体系类似，PluronicF127CD水凝胶体系通过PEG链与CD形成的超分子包合物并排列堆积得到微晶区交联点。此外，PluronicF127还含有疏水链段PPG，可通过疏水作用聚集形成另一种物理交联点。虽然PluronicF127水溶液在一定浓度和温度下即可形成水凝胶，但其固含量较高，如与CD形成超分子体系，则可大大降低凝胶体系的固含量，有利于释药后载体的代谢排出。胰岛素负载于水凝胶的亲水网络中，通过扩散缓慢释放。该超分子水凝胶对于亲水性小分子药物和多肽类药物的负载
　　释放具有普适性。
　　1实验部分
　　1。1试剂与仪器
　　PluronicF127（PEG125bPPG40bPEG125）购于Aldrich，其分子量为13400，分散度为1。02，PEG质量分数为82。5wt。PEG（两端基分别为甲氧基和羟基，分子量为2000）购于Alfa。CD购于WackerChemieAG。NaH2PO42H2O购于西陇化工股份有限公司，Na2HPO412H2O购于北京化工厂，用其配制的缓冲溶液（PBS）浓度为0。01molL，pH值为7。4。胰岛素（猪源，28Umg）购自徐州万邦金桥制药有限公司。盐酸配成0。1molL水溶液待用。噻唑蓝（MTT，荷兰Duchefa公司生产），透析袋（截流分子量为14000）和其他试剂直接使用。
　　ZHWY103B型恒温摇床（上海智诚分析仪器制造有限公司）；UV1601型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；Dmax2500X型X射线电子衍射仪（日本理学公司），Cu靶激光（40kV，40mA），波长0。1541nm，样品扫描步长为22（）min，扫描范围为535JSM6700F型扫描式电子显微镜（日本电子公司）；MULTISCANMKIII型酶标仪（美国热电公司），检测波长为570nm。
　　1。2超分子水凝胶的制备
　　制备载药超分子水凝胶的一般步骤为：在室温下（2025），将聚合物PluronicF127溶于PBS得到一定浓度的聚合物溶液。将一定量的胰岛素（需加入少量0。1molL盐酸水溶液助溶）与CD溶于PBS得到胰岛素CD水溶液。将上述两溶液混合后超声波震荡（或超声波震荡后静置）得到载药超分子水凝胶。
　　如需制备未载药水凝胶，则不加胰岛素及盐酸，其他制备步骤同上。
　　1。3载药超分子水凝胶形貌表征
　　载药超分子水凝胶的形貌通过扫描式电子显微镜（SEM）来观察，先将扫描电镜样品台贴好导电胶，再将冷冻干燥后的水凝胶样品粉末贴到导电胶上，样品喷金3040s，然后在15kV加速电压下，用SEM观察水凝胶的表面形态，并拍照。
　　1。4载药超分子水凝胶体外药物释放测试
　　载药超分子水凝胶的体外药物释放实验在PBS中进行。在1。5mL离心管中制备0。5g载药超分子水凝胶，用透析袋封口，完全浸入到装有80mLPBS的烧杯中，将烧杯置于37恒温摇床中，以30rmin速度晃动。一定间隔时间取烧杯中溶液3mL，通过紫外可见分光光度计检测胰岛素含量，检测波长为276nm。以释放出的药物百分比（）对时间（t）作图。
　　1。5细胞毒性实验
　　将人肝癌BEL7402细胞在含有5青霉素链霉素、10胎牛血清蛋白的RPMI1640灭菌培养液中培养，用细胞计数板计算细胞浓度后种植在96孔板上，密度为3000细胞每孔，置于5CO2，37的细胞培养箱中培养24h。将不同浓度的水凝胶（未载药）样品加入细胞板中，分别在细胞培养箱中培养24、48和72h后，加入20LMTT溶液，再培养4h，细胞生成蓝色MTT结晶。加入0。15mLDMSO，震荡溶解MTT结晶，使用酶标仪检测570nm处吸收强度。以未加水凝胶的细胞组为参比（认为细胞存活率为100），计算各组细胞的存活率。每组实验至少重复4次。
　　1。6动物实验
　　雄性NIH小鼠（周龄56周，来源广州动物所）根据体重进行给药。载药水凝胶给药剂量为40Ukg，给药途径为皮下注射。每个采血点3只小鼠，采血点为5min，15min，30min，1h，2h，4h，采集的血液置于冰上，分离血清冷冻保存待测。使用胰岛素检测试剂盒的交叉反应情况，试剂盒质量，进行胰岛素的药代动力学（PK）实验。
　　2结果与讨论
　　2。1载药超分子水凝胶的制备和性质
　　为了优化凝胶组分，得到在较低的固含量条件下成胶的样品，我们首先考察了不同组分含量的载药水凝胶的凝胶化情况。表1列出PluronicF127CD载药水凝胶体系的组成和凝胶化结果。体系中CD含量均为9。7wt，胰岛素含量均为4wt。G1样品中PluronicF127含量为7wt，胰岛素负载量为4wt，CD和EG单元的摩尔比〔CD〕〔EG〕是113，超声震荡5min后变成白色不流动的水凝胶。由于CD与PEG链段包合物结晶得到较大尺寸的微晶区交联点，对光有强散射作用，因此得到的超分子水凝胶呈现白色。样品G2，G3，G4的PluronicF127含量分别为6wt，5wt，4wt；〔CD〕〔EG〕分别为111，19，17。在超声波震荡8min内均可形成水凝胶。G5，G6，G7样品的PluronicF127含量分别为3wt，2wt，1wt，虽然可以形成凝胶，但是其凝胶时间较长，需要超声波震荡10min以上或震荡后静置才能凝胶化。而将PluronicF127含量降低到0。5wt时，样品G8在超声波震荡30min后静置仍不能形成水凝胶，这是由于聚合物含量过低，其中的PEG链段与CD包合物微晶区过少，不能构成稳定的三维网络结构形成超分子水凝胶。综合考虑凝胶固含量及凝胶化时间2个因素，G4体系具有较低的固含量和较短的凝胶时间，适于胰岛素缓释研究。通过X射线衍射（XRD）研究PluronicF127CD水凝胶体系中PEG链段与CD的包合作用。胰岛素的衍射曲线，没有明显的结晶峰出现。给出CD的衍射峰。与此不同，PEG（Mn2000）CD包合物（冻干粉末）具有219。4（d0。457nm）的结晶峰。样品G4（冻干粉末）在219。4处出现结晶峰，与PEGCD形成的包合物结晶峰一致，说明在上述水凝胶体系中CD穿到PEG链段上并聚集结晶。样品G2G5水凝胶冻干粉末的扫描电镜照片，均具有多孔结构，这是由水凝胶的高含水量造成。本文其他水凝胶冻干粉末具有同样的形态。需要说明的是，XRD和SEM测试的样品为冻干粉末（白色固体），而非胶态直接测试。胶态样品亦为白色固体，这是由于在体系中存在较大尺寸的粒子（如聚集胶束和包合物微晶区）造成的光散射现象所致。
　　上述超分子水凝胶组成中的PluronicF127是两亲性聚合物，在水溶液中形成以PPG为核，PEG为壳的胶束。CD穿入胶束外壳的PEG链段，形成项链状包合物。环糊精包合聚合物链的驱动力主要有疏水相互作用、范德华力、氢键相互作用以及尺寸选择等。由于CD的内腔具有疏水性，在疏水相互作用力下含有疏水乙撑基单元的PEG链会选择性地穿入CD内腔中，范德华力在该过程中也起到了协同作用。CD内腔直径为0。57nm，对适配其空腔大小的PEG链作用力最强。不同胶束的包合物聚集堆积形成物理交联点，得到超分子水凝胶。该体系中有两种类型的物理交联点，其一为PluronicF127胶束PPG核，其二为胶束PEG壳与CD包合物聚集堆积而成的微晶区。该超分子水凝胶的制备过程中完全不使用有机溶剂，适于作为蛋白类药物载体，避免有机溶剂造成蛋白类药物变性。我们将水溶性蛋白类药物胰岛素负载于水凝胶的亲水网络中。
　　2。2载药超分子水凝胶的体外药物释放
　　载药水凝胶G4和G5的体外药物释放实验在37的PBS（0。01molL，pH7。4）中进行。实验过程中，将水凝胶置于离心管中，用透析袋封口，浸入PBS中释药。释放出的胰岛素可穿过透析袋至外部PBS中，通过紫外分光光度计监测PBS中的胰岛素含量，绘制药物释放曲线。G4前5h内胰岛素释放较快，释放量约为30，而后约60h内，胰岛素持续并完全释放。由于水凝胶外部直接接触PBS，凝胶溶解释放胰岛素，导致初期释放速度稍快，待形成稳定的释放体系后，则呈现缓慢持续释放趋势。与已报道的PEG均聚物CD超分子凝胶相比，G4对胰岛素的释放时间更长且释放更完全。这表明PluronicF127CD凝胶体系由于含有2种交联点，比PEG均聚物CD凝胶体系的结构更稳定，溶解更慢，释药时间更长。固含量更低的载药水凝胶G5在前5h内胰岛素释放约38，持续释放时间约57h。G5的暴释现象比G4明显，总体释药时间相当。可能因其固含量较G4低，导致前期凝胶溶解稍快，加快了初期胰岛素释放，而后的释放行为则与G4类似。相比而言，G4暴释较少，更适合作为胰岛素载体。
　　2。3水凝胶的细胞生长抑制性
　　通过未载药水凝胶对人肝癌BEL7402细胞的作用结果，表征水凝胶材料的细胞生长抑制性。其他组分与G4相同，但不含有胰岛素的水凝胶样品，与人肝癌BEL7402细胞共同培养不同时间后的细胞生长情况。当凝胶体系混合物（PluronicF127和CD质量比为49。7）浓度为1750mgL时，与细胞共培养24h后，细胞存活率为（8314），但共培养48h和72h后，细胞存活率仅为（604）和（492）。当凝胶体系混合物浓度降为438mgL时，细胞存活率有所上升，但72h后仍不足80。当凝胶体系混合物浓度进一步下降至109和27mgL时，共培养24，48，72h后，细胞存活率均高于80。结果表明，在适当的浓度下，如小于109mgL时，水凝胶组分对BEL7402细胞的生长没有明显抑制作用，具有生物相容性，可作为药物载体在生物体内使用。
　　2。4载药超分子水凝胶的体内药物释放
　　以雄性NIH小鼠为对象研究载药水凝胶的药代动力学性质。考虑到载药凝胶可能具有缓释效果，为确保血药浓度处于检测试剂盒的最佳测试范围，凝胶制剂组给药剂量为40Ukg（有效胰岛素浓度）。通过检测不同时间后小鼠的胰岛素血药浓度，研究水凝胶载体对胰岛素体内血药时间的影响。图6为注射负载胰岛素的水凝胶G4后，小鼠体内的血药浓度曲线。8h测得的血药浓度为1gL，峰值为46gL。而注射胰岛素原药的小鼠血药浓度2h后就低于1gL了。结果表明，负载胰岛素的超分子水凝胶制剂，对于延长胰岛素的作用时间有一定效果。
　　3结论
　　利用CD和含有PEG链段的两亲性嵌段聚合物PluronicF127构筑超分子水凝胶体系，用于胰岛素的负载和缓释研究。该物理交联水凝胶的交联点包括CD与PEG链包合物堆积形成的微晶区和聚合物疏水链段聚集区。水凝胶的亲水网络可负载胰岛素等水溶性药物，体外释药曲线表明，胰岛素可在约65h内持续缓慢释放，前5h释放速率稍快。未载药水凝胶组分对细胞生长无明显抑制作用。该水凝胶体系可延长胰岛素的体内作用时间，可作为亲水性药物，尤其是蛋白类药物的优选缓释体系。