少腹逐瘀汤对气虚血瘀模型大鼠红细胞膜组分的影响研究

　　少腹逐瘀汤亦出自王清任《医林改错》，王氏治疗血瘀常用桃仁、红花、赤芍、当归、川芎等辛温或辛而微温之品。以温为主少用药性偏凉的活血祛瘀药物，体现王氏治疗瘀血偏于温散的特点，这与中医认为血属阴，得温则行，得寒则凝的思想有关。少腹逐瘀汤中药物配伍亦是如此。方中诸药相伍，温经活血，散寒止痛，以治疗寒凝气滞，瘀血结于少腹胞宫之诸证。
　　对于血瘀证研究而言，虽然有关中医宏观辨证和西医微观辨证的冲突方面的争论一直存在，但不可否认的是作为目前中西医研究衔接较好的证候，有关血瘀证在血液流变学、微循环、血液动力学方面的异常已得到公认。因此，以气虚血瘀大鼠模型，从血液流变学及红细胞膜组分变化探讨少腹逐瘀汤改善气虚血瘀的作用机制，为血瘀证相应方药药理作用及作用机制的研究提供更为客观的依据。
　　材料
　　1. 动物 清洁级雄性Wistar老龄大鼠40只，雌雄各半，体质量（27519）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供[动物合格证号SCXK（黑）2008004]。
　　2. 药物 少腹逐瘀汤由当归9g，赤芍6g，川芎6g，延胡索3g，蒲黄9g，干姜3g，肉桂3g，小茴香1.5g，没药3g，五灵脂6g 组成，上述十味药，加10倍量水浸泡0.5h，加热回流煎煮2次，第1次1.5h，第2次1.0h，合并煎煮液，浓缩成浓度为4.8g/kg的少腹逐瘀汤备用。
　　3. 仪器 Anthos 2010酶标仪（郑州博赛生物工程有限责任公司），BECKMAN低温超速离心机（美国贝克曼库尔特有限公司），LBY-N6B型血液黏度仪（北京普利生仪器有限公司），LBY-BX型红细胞变形仪（北京普利生仪器有限公司），TGL-16G型高速台式离心机（上海医用分析仪器厂），Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），蒸发光散射检测器ELSD2000（美国Alltech公司），LBY-XC全自动动态血沉测试仪（北京普利生仪器有限公司）。
　　4 . 试 剂 巯 基（南 京 建 成 生物工程研 究 所，批号20120503）；唾液酸（由南京建成生物工程研究所，批号20120503）；丙二醛（malonaldehyde, MDA）（南京建成生物工程研究所，批号20120423）；Na+-K+-ATP酶（南京建成生物工程研究所，批号20120428）。
　　方法
　　1. 分组及给药 40只大鼠按体质量随机分为4组，即少腹逐瘀汤高剂量组（4.8g生药/kg）、少腹逐瘀汤低剂量组（1.2g生药/kg）、模型组（蒸馏水）和空白组（蒸馏水）。其中除空白组给予正常饮食饮水外，正式造模前1d禁食不禁水，之后每天置于水深（301）cm，水温（402） 水槽中，力竭游泳。当大鼠出现自然下沉（头没入水面超过5s）为终止信号，将大鼠取出烘干。每天力竭游泳后再给正常饮食量的1/3饲养，每天每只大鼠按照40g/kg喂食，每日1次，连续14d。末次造模后禁食不禁水12h。
　　2. 红细胞膜的制备 取新鲜肝素抗凝血2mL以及枸橼酸钠抗凝血6mL。其中枸橼酸钠抗凝血以3 000r/min离心10min，弃上清液，除去中间的白细胞和血小板层，再以1 3比例加入等渗pH值7.4 PBS，3 000r/min离心10min，弃上清液，反复洗涤3次，最终得到干净的红细胞。按照1 80比例向红细胞中加入预冷的5mmol/L pH值7.4 Tris-HCl溶液，同时加入0.1mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF（对甲苯磺酰氟），超声15min（80Hz，20 ），放入4 冰箱过夜使其充分溶血。红细胞溶血液以15 000r/min离心10min，弃上清液，加入5mmol/L pH值7.4 Tris-HCl溶液以15 000r/min离心10min，反复洗涤3次，最后得到乳白色膜，将其1 1悬浮在PBS溶液中，膜蛋白定量后置于低温冰箱备用。
　　3. 血液流变学指标检测
　　3.1 全血黏度的测定：取肝素抗凝血1mL，用LBY-N6B型血液黏度仪测定全血黏度。
　　3.2 血浆黏度的测定：取肝素抗凝血1mL离心（3 000r/min，10min），取血浆用于血浆黏度测定。
　　3.3 红细胞变形性的测定：取肝素抗凝血20L，加入15%PVP悬浮液1mL中混匀，吸取500L采用LBY-BX型红细胞变形仪进行测定，剪切参数分别为600、800、1000s-1。
　　4. 红细胞膜组分变化
　　4.1 红细胞膜胆固醇含量测定 取制备好的红细胞膜液0.5mL，加入2.5mL提取液（氯仿 甲醇=2 1），向膜液中每加入0.5mL涡旋振荡器剧烈振荡混匀，直至全部加完后，避光室温静置2h，取下层有机层2mL，作为供试品溶液。
　　4.2 红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性测定 采用比色法测定红细胞膜上Na+-K+-ATP酶活性。
　　4.3 红细胞膜唾液酸及巯基含量测定 根据试剂盒说明书检测红细胞膜上唾液酸及巯基含量。
　　4.4 红细胞膜MDA水平检测 根据试剂盒说明书检测红细胞膜上MDA水平。
　　5. 统计学方法 采用SPSS 16.0软件处理所得数据，选用One-way ANOVA进行统计分析，数据以x-s表示。以P0.05为差异有统计学意义。
　　结果
　　1. 造模前后大鼠身体表征及体质量变化 见表1。造模后，模型组大鼠体质量显著下降，毛色暗淡无光易脱落，倦怠，便溏。与自身造模前比较，模型组及给药组体质量均明显下降（P0.01）；空白组体质量显著上升（P0.01）。
　　2. 对气虚血瘀大鼠血液流变学指标的影响 见表2。与空白组比较，模型组大鼠全血黏度及血浆黏度显著升高（P0.05，P0.01），红细胞变形指数显著降低（P0.01）。少腹逐瘀汤高剂量能够显著降低3s-1、30s-1和200s-1切变率下全血黏度（P0.01，P0.05），降低血浆年度（P0.01）。
　　3. 红细胞膜组分变化 结果见表3。与空白组比较，气虚血瘀组Na+-K+-ATP酶活力、唾液酸含量及巯基含量均显著降低（P0.05，P0.01），MDA含量和膜胆固醇含量均显著升高（P0.05）；与模型组比较，少腹逐瘀汤高剂量组可显著升高Na+-K+-ATP酶活力、唾液酸含量以及巯基含量（P0.05），低剂量组显著降低MDA含量（P0.01）。
　　讨论
　　少腹逐瘀汤温经活血，散寒止痛，以治疗寒凝气滞，瘀血结于少腹胞宫之诸证。广泛应用于妇科痛经、盆腔炎、妇科肿瘤等治疗。少腹逐瘀汤对正常雌性大鼠离体子宫自发运动的收缩和舒张强度有抑制作用。血液流变学方面，少腹逐瘀汤可改善冰水浴与肾上腺注射所致寒凝血瘀 SD大鼠全血黏度、血浆黏度、血沉、红细胞压积，调节雌二醇（E2）和孕酮（P）水平，对ADP诱导血小板聚集和凝血酶时间有显著影响。
　　实验结果表明，少腹逐瘀汤高剂量可有效改善气虚血瘀模型大鼠全血黏度，这与方中的川芎、赤芍、当归等药物在现代药理研究中有改善血液黏度作用有关。细胞水平上，少腹逐瘀汤可显著升高Na+-K+-ATP酶活力、唾液酸和巯基的含量，显著降低MDA含量。红细胞膜表面的Na+-K+-ATP酶能够维持红细胞正常形态，其活性降低会使红细胞内失K+增多，水分将随Na+进入胞内，而使红细胞体积增大，甚则如球形而水肿破裂。反之活性升高可使红细胞变形性得到改善；唾液酸是红细胞膜表面负电荷的主要来源，负电荷之间的相互排斥可以防止细胞间相互聚集，若唾液酸含量减少，使红细胞聚集性增加。因此，增加唾液酸含量可以抑制红细胞的聚集，改善低切变率下的全血黏度的变化。巯基存在于细胞膜表面，是一种极易受到自由基等因素影响的重要的膜蛋白功能基团，可保护细胞膜免遭过氧化损伤。如果膜蛋白分子通过巯基氧化缔合交联，则其构象变化将受阻，导致膜变形性降低；红细胞膜MDA的含量体现了被氧化程度。少腹逐瘀汤可增加巯基含量并降低MDA含量，都起到清除自由基，抗氧化的作用，因此两者也是相一致的。由此笔者推断少腹逐瘀汤可能是通过提高Na+-K+-ATP酶活力、唾液酸和巯基含量，而增加红细胞膜表面负电荷，增加抗氧化性，减轻自由基对红细胞攻击程度，改善红细胞的变形性，达到改善气虚血瘀模型大鼠血瘀状态。