hHSP70基因冠脉转染对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

　　毕业论文
　　【摘要】目的：研究hHSP70基因经冠脉转染对大鼠心肌抗缺血再灌注损伤的效应，并探讨其可能机制。
　　（2）选择50只SD大鼠随机分成7组（n10）。大鼠左侧开胸，暴露心脏及升主动脉和肺动脉根部，用无损伤血管钳钳夹于主、肺动脉根部，阻断循环10秒钟，同时用27号针头于左心尖部注射各组相应试剂0。1ml至左心室腔，使之在密闭的冠脉循环内分布。第、、组仅注射0。1ml生理盐水；第、组分别注射含AdvEGFP、advHhsp70（1109pfu）的生理盐水；关胸苏醒后，稳定4天，使经冠脉转染的基因充分表达于心肌。
　　（3）冠脉转染4天后，再次暴露胸腔，在动脉圆锥与左心耳根部间结扎冠状动脉左前降支（LAD）。结扎45min后，松开缝线使冠状动脉再通180min。组只穿线不结扎。组在LAD结扎5min后开放5min，并重复3次，然后再行45min缺血、180min再灌注。
　　（4）采用EvansBlue和TTC双染色法后利用imageproplus5。0测定心肌梗死面积；光学显微镜下观察心肌的炎症改变；WesternBlotting免疫印迹测定心肌基因表达的改变并利用bandscan4。5进行灰度测量进而统计计算。
　　（2）hHSP70过量表达能够增加Bcl2表达及减少caspase3活化态的生成进。
　　（3）hHSP70过量表达能减少NFB的活化。
　　（4）心肌表达的蛋白发生相应的变化，hHSP70转染组hHSP70过量表达，，Bcl2表达增加，活化的caspase3减少。
　　（2）hHSP70转染能通过抑制NFB的表达及活化及其他机制起到抑制炎症作用。
　　（3）在HSP70过表达的情况下对心肌梗死与缺血预处理组没有统计学差别，可以起到与缺血预处理急性期同等程度的心肌的保护作用。
　　关键词缺血再灌注损伤，腺病毒载体，hHSP70，凋亡，炎症
　　ABSTRACT
　　Objectives：ToobservetheprotectiveeffectagainstmyocardialischemiareperfusioninjuryaftertransferofhumanHSP70geneviacoronaryarteryandtoinvestigatethepotentialmechanisms。
　　Methods：
　　（2）50SDratswererandomlypidedinto5groups（n
　　10）。Theleftthoracotomywasperformedandthepericardiumopenedwiththeexposureoftheheartandthebaseofpulmonaryarteryandascendingaorta。Pulmonaryarteryandascendingaortawereoccludedbyapplyinganontraumaticvascularclamptoachievecompletecessationofoutflow，atthesametimeadenovirusparticles（1。0109pfu）in0。1mlof0。9salinesolutionwereinjectedintotheleftventriclecavityusinga1mlsyringewitha27gaugeneedle。After10secondsofcompleteoutflowocclusion，theclampwasremoved。0。1mlsalinesolutionalonewasinjectedintotheratheartinGroup。InGroupAdvEGFPwasinjected。Allofthemwereclosedandrecovered，andthenstabilizedwithoutoperativeinterventionfor4day。
　　（3）After4days，arepeatthoracotomywasperformedtoexposetheanteriorsurfaceoftheheart。Theproximalleftanteriordescendingcoronaryartery（LAD）wasidentifiedanda60suture（Ethicon）wasplacedaroundthearterybelowtheleftatrialappendageandthesurroudingmyocardium。Regionalleftventricularischemiawasestablishedfor45minbyligationofLAD。Ischemiawasconfirmedbydiscolorationofmyocardiumandbychangesincardiacrhythm。Attheendoftheischemiaperiod，theligationwasloosenedandreperfusionwasachievedfor180min。Group（shamoperatedgroup）servedassurgicalcontrolsandweresubjectedtothesamesurgicalproceduresasthetheexperimentalgroup，withtheexceptionthattheLADwasnotligated。Groupweresubjectedtoischemicpreconditioning（IPC）beforeIRbyrepeatedischemiaandreperfusionthrough3cyclesofinducedLADischemiafor5minfollowedby5minofreperfusion。
　　（2）GenehHSP70overexpressioncanraiseBcl2production、restraincaspase3activated。
　　（3）GenehHSP70canrestrainNFBactive。
　　（4）Theexpressionofproteininratheartaltered。InAdvHSP70grouptheheexpressionofHSP70andBcl2wereraised，activatedcaspase3decreased。
　　Conclusions：
　　（1）TransfectionofHSP70inhibitsinflammationthroughNFBdownregulation。
　　（2）TransfectionofHSP70suppressesapoptosisthroughincreasingBcl2productionanddecreasingCaspase3activation。
　　（3）TransfectionofHSP70demonstratessynergisticeffectsofmyocardialtolerancetoIRinjury，whichcananaloguetheprotectiveeffectofIPCtoalargerdegree。
　　KEYWORDS：ischemiareperfusioninjury，adenovirusvector，hHSP70，apoptosis，inflammation
　　目录
　　中文摘要
　　英文摘要
　　英文缩略4
　　前言5
　　第1章材料与方法9
　　1。1重组腺病毒构建9
　　1。2动物15
　　1。3手术器械和仪器试剂15
　　1。4方法16
　　1。5统计处理19
　　第2章结果202。2各组心肌HSP70表达量检测22
　　2。3心肌梗死范围结果分析23
　　2。4心肌缺血范围结果方差分析23
　　2。5HSP70转染对心肌的炎症作用242。5。2NFB结果分析26
　　2。6细胞凋亡的结果分析262。6。2HSP70对Caspase3激活的影响27
　　附图28
　　第3章讨论29
　　第4章结论32
　　第5章参考文献33
　　综述36
　　致谢48
　　主要英文缩略词表
　　AdAdenovirus腺病毒
　　AdvAdenoviralvector腺病毒载体
　　AdvEGFPAdvencodingEGFP腺病毒介导的增强型绿色荧光蛋白基因
　　Bcl2Bcellleukemialymphoma2B细胞淋巴瘤因子2
　　EGFPenhancedgreenfluorescenceprotein增强型绿色荧光蛋白
　　CPBcardiopulmonarybypass心肺转流术
　　IPCIschemicPreconditioning缺血预处理
　　SODsuperoxidedismutase超氧化物歧化酶
　　HGFhepatocytegrowthfactor肝细胞生长因子
　　HSPheatshockprotein热休克蛋白
　　IGFinsulinlikegrowthfactor胰岛素样生长因子
　　IL10interleukin10白细胞介素10
　　IRIschemiaandreperfusion缺血再灌注
　　LUCluciferase荧光素酶
　　MLCmyosinlightchain肌球蛋白轻链
　　mRNAmessengerribonucleicacid信息核糖核酸
　　OFROxygenfreeradical氧自由基
　　AIFApoptosisinducingfactor凋亡诱导因子
　　Pfuplaqueformingunit斑块形成单位
　　FGFFibroblastgrowthfactor成纤维细胞生长因子
　　TNFTumornecrosisfactor肿瘤坏死因子
　　TUNELTdTmediateddUTPdigoxigeninnickendlabeling原位缺口末端
　　标记技术
　　VEGFvascularendothelialgrowthfactor血管内皮细胞
　　生长因子
　　前言
　　缺血再灌注损伤是指器官、组织在缺血的基础上恢复血液灌注时，细胞代谢功能障碍及结构破坏进1步加重的现象。随着心脏骤停复苏成功率提高，动脉搭桥术、PTCA、心脏体外循环术的广泛开展，心肌的缺血再灌注损伤的预防和治疗成为1个待进1步解决的课题。防治心肌IR损伤的有效办法除了尽快恢复心肌血流的再灌注外，控制炎症和抑制凋亡，就成为防治心肌IR损伤的主要途径。HSP70与炎症反应