高效液相色谱法同时测定右旋糖酐发酵液中的多种糖分

　　右旋糖酐为一种由若干葡萄糖分子脱水形成的无毒无害的高分子聚合物，具有免疫刺激、抗炎症、抗微生物、抗感染、抗肿瘤、抗辐射、降低胆固醇以及治愈创伤等生物学活性。中低分子量的葡聚糖作为血浆补充剂在医学、兽药生产被广泛应用。近年来，将中低分子量葡聚糖的衍生物制备药物载体输送系统成为国内外学者研究的热点，具有广阔的应用前景。
　　右旋糖酐的合成体系组分复杂，随着右旋糖酐的生成，发酵液黏度增加，一般常用测定体系黏度的方法对转化过程进行监测。但转化体系的黏度不仅与右旋糖酐的生成量和分子量有关，还会受到发酵液中其他组分变化的影响，难以准确监测转化过程的进行。
　　单一糖分或多种糖分含量的测定常用化学法、比色法、旋光法、气相色谱法等方法。化学分析方法只能测定体系中各种糖分的总量，而不能分别测定各种糖分的含量。气相色谱法虽可分别测定不同糖的含量，灵敏度高，但由于糖难以汽化，必须进行衍生化反应才可检测，使检测步骤繁琐。能够快速、准确同时测定多种低分子量糖的检测方法并不多，其中高效液相色谱法是一种测定低分子量糖较好的方法。本文针对右旋糖酐转化体系的特征，采用流动相乙腈水溶液预处理发酵液，使其中右旋糖酐沉淀，消除对发酵液中糖分测定的影响，选用OSMOSILSugar-D(4.6 mm I.D.250 mm0.46 m)色谱柱，通过色谱条件选择，同时测定右旋糖酐发酵液中蔗糖、果糖和葡萄糖等糖分的含量，测定方法操作简单，快速准确，为监控生物转化合成右旋糖酐过程提供了一种技术途径。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　蔗糖、果糖、葡萄糖(标准品)、乙腈(色谱纯)：国药集团化学试剂有限公司;菌种(CICC20724)：中国工业微生物菌种保藏管理中心。
　　1.2 仪器与设备
　　LC-20AD高效液相色谱仪(配RID-10A示差折光检测器)：日本岛津公司;COSMOSIL Sugar-D色谱柱：日本NACALAI TESQUE公司;高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械公司;恒温摇床培养箱：瑞士Adolf Kuhner公司;冷冻离心机：湖南湘仪公司。
　　1.3 方法
　　1.3.1 色谱条件 色谱柱：COSMOSIL Sugar-D(4.6mm I.D.250 mm0.46 进样量20 L，柱温：35.0  ，检测器温度：40.0  。
　　1.3.2 色谱条件选择 分别称取2.5 g(精确至0.0001g)经干燥至恒重的蔗糖、果糖、葡萄糖，用二重蒸馏水糖标准储备液3 mL、葡萄糖标准储备液4mL混匀，作为混合标准液，用0.45 m的水系针式过滤头过滤，取滤液进样检测。改变流动相组成、流速，考察对3种混合糖的分离效果。
　　1.3.3 标准曲线绘制 取25 g/L蔗糖标准储备液以二重蒸馏水逐级稀释，配制成浓度梯度为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 g/L的蔗糖标准溶液。标准溶液分别以0.45 m滤膜过滤，取滤液进样检测，记录色谱图和峰面积。以峰面积为横坐标、质量浓度为纵坐标制作蔗糖标准曲线。
　　2 结果与分析
　　2.1 色谱条件的选择
　　2.1.1 流动相的选择 按1.3.1节色谱条件，在流速为1.0 mL/min时，分别采用二次蒸馏水、40%、60%、70%和80%乙腈水溶液为流动相，分析混合标准液，考察不同的流动相组成对3种糖分的分离效果。
　　2.1.2 流速的选择 按1.3.1节色谱条件，流动相为80%乙腈水溶液，分别采用0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL/min，5个流速，分析混合标准液，考察流速对3种混合糖的分离效果。
　　2.2 标准曲线的绘制
　　在选定的色谱条件下，测定出不同质量浓度的蔗糖、果糖、葡萄糖标样相对应的出峰面积可绘制出蔗糖、果糖、葡萄糖的标准曲线。以出峰面积为横坐标，标样的质量浓度为纵坐标，蔗糖、果糖、葡萄糖标准曲线相对应的回归方程、线性范围和相关系数。
　　2.3 加标回收实验及样品的检测
　　2.3.1 加标回收实验 准确称取不同发酵时间的发酵液2组共10个样品，对3种糖进行3个水平添加，按1.3.2节处理，每个水平平行测定5次，平均回收率为95.2%~104.0%，相对标准偏差在1.8%~3.2%之间。
　　2.3.2 发酵过程样品的检测 分别准确称取发酵0、15、24、36、48 h的发酵液样品，按1.3.2节处理。
　　3 结论
　　建立了右旋糖酐发酵液中蔗糖、果糖、葡萄糖3种糖分含量的高效液相色谱定量分析方法。发酵液中加入流动相乙腈水溶液使右旋糖酐析出，以消除其对糖分测定的干扰。采用OSMOSILSugar-D液相色谱柱、80%(V/V)乙腈水溶液为流动相、流速为1.0 mL/min，实现了发酵液中蔗糖、果糖、葡萄糖的理想分离。在蔗糖质量浓度为0.1~15.0 g/L，果糖和葡萄糖质量浓度为0.5~25 g/L范围内，对糖分质量浓度与其峰面积进行线性回归分析，其相关系数在0.9994~0.9999之间，平均加标回收率为95.20%~104.00%，相对标准偏差在1.8%~3.2%之间。本方法可直接同时测定右旋糖酐发酵液中蔗糖、果糖、葡萄糖等3种糖分质量浓度，方法操作简单，重复性好，回收率满足要求，检验成本低，实用性强。可以满足右旋糖酐发酵液中糖分快速、准确检测的需要。