裂褶菌子实体中多糖及蛋白质含量的测定

　　裂褶菌(Schizophyllum commne Fr.)又称白参、树花、八担柴，隶属于真菌门(Eumycophyta)，担子菌纲(Basidiomycetes)，伞菌目(Agaricales)，裂褶菌科(Schizophyllaceae)，裂 褶 菌 属(Schizophyllum)，食用有滋补、强身的作用。近年来，日本及欧美等国在分子生物学、抗癌活性物质和优良菌株的选育等方面进行了广泛的研究，我国李梦杰等对其培养研究并分离出了产漆酶的裂褶菌 GGHN08-104 菌株。裂褶菌子实体中含有多种活性成分，郭孟璧等对裂褶菌挥发油的化学成分进行了研究，结果鉴定出(Z，Z)-9，12- 十八二烯酸等 12 种化学成分，毛绍春等用硅胶柱反复层析从子实体中分离出了麦角甾醇等多种化合物。药用真菌目前研究最多的是真菌多糖，裂褶菌多糖可增强巨噬细胞的吞噬活性，对巨噬细胞、自然杀伤性细胞有激活作用，能提高白细胞介素产生能力，对体外培养的人肝癌 HepG2、Bel-7402 及喉癌 Hep-2 细胞的生长繁殖具有显著的抑制作用，所以其子实体中多糖含量可以作为裂褶菌食药用价值高低的指标之一。王凤仙等测定出裂褶菌子实体中含有 15种氨基酸，赵琪等综述裂褶菌能产生多种酶，所以对其蛋白质含量测定也可以衡量其食药用价值的高低。本研究建立了裂褶菌子实体中多糖和蛋白含量的测定方法，具有一定的理论和实际意义。
　　1 仪器与材料
　　紫外 - 可见分光光度计(UV2450 日本岛津)，葡萄糖对照品、牛血清蛋白对照品(购于北京索莱宝科技有限公司)，裂褶菌子实体(采于长春中医药大学校园)。
　　2 方法与结果
　　2.1 子实体多糖含量的测定
　　采用 3，5二硝基水杨酸定糖法测定裂褶菌子实体中多糖的含量。
　　2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取 105 干燥至恒重的无水葡萄糖标准品 25mg，置 25mL 容量中加水定容至刻度，即得 1mg/mL 葡萄糖的标准品
　　溶液。
　　2.1.2 供试品溶液的制备(1)供试品溶液的制备：精密称取子实体粉末 2.5081g，加热回流提取 3次，每次 30min，合并滤液并浓缩，定容至 50mL 量瓶中，即得。作为总糖供试品和还原糖供试品备用。(2)总糖供试液的制备：精密量取供试品溶液2mL，置 25mL 容量瓶中，加 6N 盐酸 8mL，置沸水浴加热 30min，冷却，加 1 滴酚酞指示剂，用 40% 氢氧化钠溶液中和至微红色，加水定容至刻度，即得总糖供试液。(3)还原糖供试液制备：即为上述供试品溶液。
　　2.1.3 方法学考察
　　2.1.3.1 线性关系考察 精密量取葡萄糖标品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL 分别置于 25mL 容量瓶中，均加蒸馏水至 2mL，再加入1.5mL 3，5 -二硝基水杨酸试剂溶液，水浴 5min，定容至刻度，摇匀。479nm 波长下测定样品吸光值。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求得回归方程为 Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，葡萄糖在 0.0120   0.0400mg/mL 范内呈良好的线性关系。
　　2.1.3.2 精 密 度 试 验 取 葡 萄 糖 对 照 品 溶 液0.7mL，置于 25mL 量瓶中，加蒸馏水至 2mL，再加入1.5mL 3，5 -二硝基水杨酸试剂溶液，水浴 5min，定容至刻度，摇匀。479nm 波长下连续测定 6 次吸光度值，RSD 值为 0.5981%。表明仪器精密度良好。
　　2.1.3.3 稳定性试验 取供试品溶液 1mL，置于25mL 量瓶中，加水至 2mL，再加入 1.5mL 3，5 -二硝基水杨酸试剂溶液，水浴 5min，定容至刻度，摇匀。置于 479nm 波长下，分别于 0、0.5、1.0、1.5、2h测定吸光度。其 RSD 值为 0.7197%，表明供试品溶液在 2h 内稳定。
　　2.1.3.4 重复性试验 取同一子实体样品 5 份，分别按照 2.1.2 项下方法制备供试品溶液，分别取1mL，置于 25mL 量瓶中，加蒸馏水至 2mL，再加入1.5mL 3，5 -二硝基水杨酸试剂溶液，水浴 5min，定容，摇匀。置于 479nm 波长下测定吸光度值。其RSD 值为 1.0752%，表明本方法重复性良好。
　　2.2 蛋白质的含量测定采用考马斯亮蓝法测定裂褶菌子实体中蛋白质的含量。
　　2.2.1 标准蛋白质溶液的配制 精密称定 20mg 牛血清蛋白，置于 10mL 的容量瓶中，用生理盐水定容至刻度，即得 2mg/mL 标准蛋白质溶液。
　　2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取子实体粉末5.0082g，加 8 倍量生理盐水浸渍 24h，滤液透析浓缩，定容至 10mL 量瓶中，即得供试品溶液。
　　2.2.3 方法学考察
　　2.2.3.1 线性关系考察 精密加入标准蛋白溶液0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mL 于试管中，分别加生理盐水至 0.2mL，再加入考马斯亮蓝试剂10mL，混匀，5min 后于 595nm 波长下测定其吸光度值。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程：Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，蛋白质在0.0078   0.0312mg/mL 范内呈良好的线性关系。
　　2.2.3.2 精密度试验 取供试品溶液，按照 2.2.2 项下制备，移取 0.2mL 溶液，依法在 595nm 波长下测定其吸光度，重复 6 次，其 RSD 值为 0.5142%，表明仪器精密度良好。
　　2.2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液，按照 2.2.2 项下制备，移取 0.2mL 溶液，按照测定法每间隔 5min测定其在 595nm 波长下吸光度，测定 20min 内吸光度值的变化，其 RSD 值为 0.5920%，表明样品溶液在 20min 内稳定。
　　3 讨论
　　裂褶菌子实体中多糖浓度在0.0120 0.040mg/mL 范围内具有良好的线性关系，回归方程为 Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子实体多糖含量为 7.26%;蛋白浓度在 0.0078   0.0321mg/mL 范围内具有良好的线性关系，回归方程为 y=20.0830x+0.1451，r=0.9997，子实体总蛋白含量为 0.26%;本研究建立的方法简便、快速、准确，重复性好，为裂褶菌子实体多糖和蛋白质含量的测定提供了依据。多糖有提高免疫力等多种良好的药理作用，所以具有良好的研究与开发前景，本实验为开发新型药物提供了理论依据。