动物实验LOXsiRNA人肝癌HepG2细胞裸鼠瘤模型的建立

　　siRNA的特异性有效保证了哺乳动物细胞中RNAi效应的特异性结合已有的高效基因导入系统，使得 RNAi在那些由于基因表达异常增高而引起的疾病（如肿瘤、病毒感染）中的作用优于目前以抑制基因表达为目的而采用的反义技术和核酶等方法。5-LOX是催化花生四烯酸（AA）生成白三烯（LT）和氢二十碳四稀酸（5HETE）的关键酶，大量实验研究已证实抑制5-LOX可以抑制多种肿瘤的生长，包括肝细胞癌。肝细胞癌已经严重威胁人类健康，建立合适的动物模型是研制抗肿瘤药和了解肿瘤发展的重要手段。
　　No.1
　　动物的选择
　　选取4 6周龄的A/J裸小鼠。
　　No.2
　　造模方法
　　01
　　细胞转染及稳定转染细胞克隆的筛选及转染效力的验证
　　选择处于对数生长期的人肝癌HepG2细胞，调整细胞密度为1.2 105个/ml接种底部铺有小圆玻片的6孔培养板，每孔2ml，保证转染前汇合度80%左右。应用脂质转染试剂LipofectamineTM2000将pRNAT-U6.1-5-LOX-siRNA和空质粒pRNAT-U6.1分别转染人HepG2细胞，分别为阳性干扰组（转染干扰质粒）、阴性对照组（转染空白载体质粒），并设立空白组（未做任何转染），于瞬时转染48h，收集细胞，做荧光定量PCR检测。荧光定量PCRSYBR Green I荧光染料法检测转染细胞5-LOX的表达，验证转染效力：TR-Lzol试剂抽取总RNA，反转录制备cDNA，按照说明书的操作步骤进行。反转录反应条件的设置：25  10 min，42 60 min，85 5min；荧光定量PCR反应体系（共50μl）：2 PCR buffer 25 μl，Primers（25 μmol/L）1.2μl，2 SYBR Green I 0.3μl，DNA模板1μl，dH2O 22.5μl；扩增条件：94 4min，94 20s，60 30s，72 30s循环35次，72 检测信号。引物设计：5LOX Foward：5＂-ATGCCTCCTGTCCTTTTCC-3＂，5LOX Reverse：5＂-ACCTGGTCGCCTCGTAGT-3＂，扩增片段约为160 bp；β-Actin Forward:5＂-TGACCTGGACATCCCCAAAG-3＂, β-Actin Reverse：5＂-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3＂，扩增片段约为205 bp。
　　02
　　荧光定量PCR结果表示方法
　　目的基因表达量=2- CT， CT=（CT目的基因-CT内标基因）实验组-（CT目的基因-CT内标基因）对照组，β-Actin 做为内标基因。2- CT：实验组目的基因相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到目的基因相对于内参基因的定量。
　　03
　　裸鼠皮下移植瘤模型的建立
　　将上述转染后细胞在G418选择性培养基中筛选具有抗性的单细胞来源的细胞克隆，扩大培养。分别获取 pR-NAT-U6.1-5LOX-siRNA和空质粒 pRNAT-U6.1转染的细胞，裸鼠随机分成三组：转染组、转染空载体组、未转染组（每组6只）。调整三种细胞密度为1 107个/ml，在无菌条件下于裸鼠背部皮下接种细胞悬液，按每只1 107个细胞。饲养21天后对裸鼠进行处死。测量肿瘤最长径和与之垂直的短径，按下式计算肿瘤体积（V）和肿瘤衰退率（R），V=长径 短径2 0.5，R=转染组平均肿瘤体积/未转染组平均肿瘤体积。
　　04
　　Western blot 检测移植瘤体组织中5-LOX蛋白表达
　　取各组裸鼠移植瘤组织，用遇冷的PBS洗2次，剪碎，匀浆，加入细胞裂解液，4 裂解20min，收集细胞裂解液，12000r/min离心30min，收集上清液，提取总蛋白。用Bradford比色法测定裂解液中总蛋白含量。取40μl样本进行SDS-PAGE 电泳分离，通过电转印法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶上转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶4 封闭过夜后加入一抗（浓度1：500），4 温度中孵育2h，TBST洗涤3次，每次10 min。TBS 洗膜后放入辣根过氧化物酶标记的二抗（1：5000），37 孵育1h，再用TBST洗3次，每次10min，加入化学发光剂，进行化学发光反应。应用软件分析 Western blot结果。05
　　RT-PCR 检测移植瘤瘤体组织中5-LOXmRNA的表达
　　取各组移植瘤组织，采用TRIzol试剂提取总RNA，步骤按试剂盒操作说明书进行。按逆转录试剂盒（Promega）说明书进行逆转录。将反转录产物 cDNA于95 变性5min，开始PCR热循环：94 预变性3min；然后每个循环：94 变性45s，55 退火45s，72 延伸45s，共35个循环；最后72 终延伸5 min，4 保存。制备1.5%琼脂糖凝胶，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶分析系统进行照相。对条带进行光密度扫描，mRNA的表达强度=目的基因条带灰度值/β-actin条带灰度值。引物设计：5-LOX上游引物为5＂-CCCGGGCATGGAGAGCA-3＂，下游引物为5＂-GCG-GTCGGCAGCGTGTC-3＂，扩增片断长度416bp；β-Actin上游引物为5＂-ACCCACACGGTGCCATCTACGAGG-3＂，下游引物为5＂-AGCTCGTAGCTCTCTCCAGGGAGG-3＂，扩增片断长度250 bp。
　　No.3
　　结果
　　01
　　HepG2细胞转染后荧光定量PCR检测5-LOX基因表达量
　　3组细胞中，阳性干扰组的5-LOX基因表达量与阴性对照组比较最低（P<0.01），而阴性对照组与空白组比较无统计学意义（P>0.05）。
　　02
　　5-LOX siRNA 转染对裸鼠移植瘤瘤体生长的影响
　　每组6只裸鼠均在背部皮下肉眼可见肿瘤，成瘤率为100%。转染空载体组和未转染组5~7d后可观察到皮下结节，而转染组10 12d才可观察到肿瘤结节，肿瘤直径随时间推移逐渐增大，肉眼见肿瘤位于皮下，表面凹凸不平，呈结节状，实质性。本实验中，无一只裸鼠自然死亡。进一步解剖肿瘤，肿瘤表面有出血灶，外观呈粉红色，剖面成鱼肉状，中间部分大量坏死，呈灰白色。但各脏器肉眼观察均未发现转移灶。统计分析显示：转染组肿瘤体积与未转染组体积相比具有统计学意义（P<0.01），转染空载体组与未转染组瘤体体积比较无统计学意义（P>0.5），转染组的肿瘤衰退率52.09%。
　　03
　　免疫印迹（western-blot）检测移植瘤组织5-LOX中蛋白表达水平的影响
　　Western blot结果显示，转染组5-LOX蛋白的表达量与转染空载体组、未转染组差异有统计学意义（P<0.01），而转染组与未转染组之间差异无统计学意义（P>0.05）。
　　04
　　RT-PCR检测移植瘤组织中5-LOX mRNA表达水平的影响
　　琼脂糖凝胶电泳结果显示，内参照β-Actin表现为扩增片断长度为250bp，宽窄及深浅基本一致的条带，而5-LOXmRNA表现为扩增片断长度分别为416bp出现宽窄和深浅不一的条带。经密度扫描并计算出的相对系数显示，转染组肿瘤组织中5-LOX mRNA的表达明显低于空载体组和未转染组（P<0.01）。
　　No.4
　　总结
　　引入iRNA干扰技术，根据5-LOX基因序列制备双链RNA注入HepG2细胞内引起该基因编码的mRNA降解，使5-L0X的表达受抑。该技术具有序列上的高度特异、抑制基因表达的高效性、化学性质的高度稳定性、抑制作用的迅速性以及 RNAi效应的依赖性和避免应用药物抑制剂出现的毒
　　负作用的缺点，为实验提供更可靠的数据，并在基因研究领域中已逐渐成为常规技术。