普通PCRVS荧光定量PCRVS数字PCR

　　上世纪八十年代Cetus Corporation公司的化学家Kary Mullis发明了PCR，如今DNA扩增俨然已经成为了生物学研究的基础。三十多年以来，人们为了解决研究中出现的新问题新需求，不断对这一经典技术进行改良。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，PCR技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。如今PCR技术早已走出实验室，在遗传学鉴定和疾病诊断中发挥着巨大的作用，在越来越广阔的领域里焕发着新的活力。
　　PCR方法大比拼
　　PCR的原理在这里无庸赘述。多年来，研究者们已经在此基础上开发了一系列衍生技术。目前的PCR方法主要可以分为三类：终点PCR、qPCR和dPCR。
　　终点PCR
　　终点PCR是最原始、最简单的PCR方法，如今仍在被我们广泛使用。使用者只能在PCR反应结束之后，通过凝胶电泳、毛细管电泳等方法对产物进行检测。终点PCR本身是无法定量的，因为该反应产出的DNA量不一定能反映最初情况。举例来说，不同样品和序列的扩增效率是有差异的。
　　qPCR和dPCR
　　研究者们通过两种途径克服了PCR定量分析的挑战：实时定量PCR（qPCR）和数字PCR（dPCR）。qPCR主要是利用插入性染料或荧光探针（比如TaqMan），人们可以通过监控PCR过程中的荧光强度比较多个样品的DNA水平。数字PCR（dPCR）的基本工作原理很简单，先将样品划分为多个PCR反应，每个反应最多只含有一个模板。然后通过计数正负反应来确定初始样品中模板分子的数量。
　　SYBR® Green是一种在qPCR中广泛使用的插入性DNA染料。随着PCR循环的连续进行，这种染料的荧光强度会不断增强，从而可以使人们对反应中的DNA进行定量。SYBR Green法比探针法成本低，使用也更为方便。不过这种方法也存在着与生俱来的弊端，SYBR Green方法产生的非特异性产物较多，会导致高背景和假阳性。尽管如此，这一久经考验的技术仍然颇为流行，许多研究人员都是SYBR Green法的忠实拥护者，愿意接受这个技术的小瑕疵。
　　虽然qPCR和dPCR都能够对样品中的核酸进行定量，但它们有一个重要的差别。qPCR只能实现相对定量（比如样品A的靶序列是样品B的两倍），除非用标准品生成一个标准曲线。而数字PCR本身就是绝对定量的，不需要做标准曲线。另一方面，qPCR技术更为成熟名头也更响，市面上有大量的商业化产品可供选择。dPCR目前还是个小鲜肉，应用没有qPCR那么广泛，价格也更昂贵一些。与dPCR相比，qPCR更适合高通量分析，而且动态范围很宽。
　　dPCR一般来说更为精确。qPCR能够轻易分辨两倍的浓度差异（比如5拷贝和10拷贝），但在微小差异面前比较无力。而dPCR在理论上能鉴别差异小于20%的拷贝数，比如5拷贝和6拷贝。这种精确性在有些方面特别有帮助，比如定量涉及染色体重排的基因拷贝数，或者定量癌症患者血液中的循环生物学指标。由于dPCR分液相当于稀释样品，而且在反应结束时读取数据，dPCR比qPCR更能抵抗抑制剂。
　　图1.PCR方法及应用
　　重组酶聚合酶扩增RPA（Recombinase Polymerase Amplification）被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA主要依赖于三种酶：能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶。该反应的最适温度在37°C -42°C之间，无需变性在常温下即可进行，这无疑能大大加快扩增速度。RPA检测的灵敏度也很高，能够将痕量的核酸（尤其是DNA）模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。RPA用不着复杂的样品处理也不需要温控设备，适合无法提取核酸的实地应用，真正实现便携式的快速核酸检测。英国公司TwistDx Inc以RPA为基础开发了TwistAmp核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。