紫外可见分光光度计浅解

　　图1.紫外-可见分光光度计外观图
　　简介：紫外-可见分光光度计是由光源、单色器、吸收池、检测器和信号处理器等部件组成。光源的功能是提供足够强度的、稳定的连续光谱。紫外光区通常用氢灯或氘灯，可见光区通常用钨灯或卤钨灯。单色器的功能是将光源发出的复合光分解并从中分出所需波长的单色光。色散元件有棱镜和光栅两种。可见光区的测量用玻璃吸收池，紫外光区的测量须用石英吸收池。检测器的功能是通过光电转换元件检测透过光的强度，将光信号转变成电信号。常用的光电转换元件有光电管、光电倍增管及光二极管阵列检测器。分光光度计的分类方法有多种:按光路系统可分为单光束和双光束分光光度计；按测量方式可分为单波长和双波长分光光度计;按绘制光谱图的检测方式分为分光扫描检测与二极管阵列全谱检测。
　　原理：分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。
　　分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。它是带状光谱，反映了分子中某些基团的信息。可以用标准光图谱再结合其它手段进行定性分析。
　　根据Lambert-Beer定律说明光的吸收与吸收层厚度成正比，比尔定律说明光的吸收与溶液浓度成正比;如果同时考虑吸收层厚度和溶液浓度对光吸收率的影响，即得朗伯-比耳定律。即A=εbc，(A为吸光度，ε为摩尔吸光系数，b为液池厚度，c为溶液浓度)就可以对溶液进行定量分析。
　　将分析样品和标准样品以相同浓度配制在同一溶剂中，在同一条件下分别测定紫外可见吸收光谱。若两者是同一物质，则两者的光谱图应完全一致。如果没有标样，也可以和现成的标准谱图对照进行比较。这种方法要求仪器准确，精密度高，且测定条件要相同。
　　实验证明，不同的极性溶剂产生氢键的强度也不同，这可以利用紫外光谱来判断化合物在不同溶剂中氢键强度，以确定选择哪一种溶剂。
　　分类：分光光度计从分光元件来讲可分为棱镜式和光栅式两种，也有光栅加棱镜的高档分光光度计，现今的分光光度计大部分采用光栅分光。从结构上来区分可分为单光束、准双光束、双光束和双波长分光光度计。
　　（1） 棱镜式分光光度计
　　棱镜式分光光度计采用棱镜作为分光元件，是分光光度计诞生前后分光的主要元件，随着电气化的发展，棱镜分光给结构设计带来了很大的麻烦，应用起来不够灵活，所以逐渐的被淘汰了，但在相当长的一段时间内，国内外的主要厂商都采用棱镜，到目前为止还有部分国内厂商在721、751等分光光度计上采用棱镜作为分光元器件。我们后边讨论的都是光栅式分光光度计，棱镜式后面不作分析。
　　（2） 单光束分光光度计
　　1945年美国Beckman公司推出的世界第一台成熟的分光光度计，就是单光束分光光度计。单光束分光光度计只有一束单色光、一只比色皿、一只光电转换器。这种分光光度计测试过程简便，有高、中、低档之分。
　　低档的目前国内有两种：一种是手动设置波长，通过旋钮转动刻度盘，同时带动光栅，从而达到设置波长的目的；一种是自动设置波长，通过电机带动扇形齿轮，同时带动光栅，从而达到自动设置波长的目的。这两种单光束分光光度计，之所以说它们低档，主要是因为它们的技术指标相对较差，他们的主要技术指标像：波长准确度一般在±2nm，波长重复性一般在1nm，功能也相对简单，测试结果误差较大。例如目前国内用的较多的型号有：721（上分）、722（上分）、751（上分）、752（上分）、754（上分）、T6（北京普析）。
　　中档的目前国内一般采用丝杆结构，采用自动波长设置，电路设计也比较合理，采用较好的屏蔽技术和滤波技术，成品仪器比较稳定，也不易受外界的干扰，但是这种仪器，每个厂家做出来的效果不尽相同，有的做出来很不稳定，有的却很可靠，因为每个厂家的技术存在很大的差异，特别是在关键点上的处理，例如190nm处的稳定性，国内目前很少有厂家做的好，有的厂家甚至在200nm处还很不稳定，220nm处的杂散光，国内厂家目前一般在0.2%T，很少有厂家能做到0.1%T以下，这种档次的仪器的波长准确度一般能做到±0.5nm，波长重复性一般能做到小于0.3nm。这种档次的仪器目前的性价比比较好，销量也很不错。像国内现在比较流行的型号如：756。
　　高档的单光束分光光度计，一般采用非常先进的微机处理技术，电路设计也是非常的出色，结构设计也是极为合理，光路准确可靠，此类单光束分光光度计基本可以和准双光束以及双光束媲美，主机功能丰富，界面清晰，读数直观。
　　单光束紫外可见分光光度计的基本结构
　　图2.单光束紫外可见分光光度计的基本结构图
　　（3） 准双光束紫外可见分光光度计
　　所谓准双光束，就是有两束光，一束通过比色皿，另一束光直接进入光电转换器。严格意义上来讲准双光束属于单光束。国内出现准双光束分光光度计主要是因为国内部分分光光度计厂家的电路设计和结构设计有缺陷，试图通过用一束光进入光电转换器来作抵消，从而保证仪器的稳定性，但在通常情况下和单光束没有什么区别，对测试结果来说也是如此。准双束有两种：一种是两束单色光，一束单光束经过比色皿进入光电转换器，一束光直接进入光电转换器；另一种是一束单色光和一束复合光，一束单色光经过比色皿进入光电转换器，一束复合光直接进入光电转换器。后一种因为存在一束复合光，通常情况下不但不能起到抵消的作用，反而会给测试结果带来不确定因素，所以不常用。前一种现在用的相对较多。
　　两束单色光准双光束紫外可见分光光度计的基本结构：
　　图3.两束单色光准双光束紫外可见分光光度计的基本结构图
　　（4） 双光束紫外可见分光光度计
　　双光束紫外可见分光光度计就是有两束单色光，并且两束光都经过比色皿的紫外可见分光光度计，此类分光光度计的光源波动、杂散光、电噪声的影响都能部分抵消，但同时因为一束光被分成两束光，能量变低，产生了光的波动、杂散光、电噪声。主要应用在待测溶液和参比溶液随时间的变化浓度也随之变化的实验中，起到随时跟踪，抵消应浓度的变化而给测试结果带来的影响。关于单光束和双光束的优劣，目前还是众说纷纭，各有优缺点，实际应用过程中应该根据自己的需要选择合适的分光光度计。双光束分光光度计也有两种：一种是一只光电转换器，另一种是两只光电转换器。
　　双光束紫外可见分光光度计的基本结构
　　图4.双检测器结构图
　　图5.单检测器结构图
　　（5） 双波长紫外可见分光光度计
　　双波长紫外可见分光光度计都采用两个单色器，光源发出的光被两个单色器分别分离出波长为λ1和λ2，用斩波器将两束单色光λ1和λ2交替入射到同一试样中，接受器交替地接受经过试样吸收后的这两束单色光，并把它们变成电信号，电信号经过处理后转化为它们之间的吸光度差ΔA，通过下列公式可计算出试样中待测物质的浓度。
　　ΔA=Aλ2- Aλ1=（ελ2-ελ1）bc
　　ΔA为物质在λ2波长下吸光度和物质在λ1波长下吸光度的差值
　　Aλ2为物质在λ2波长下吸光度
　　Aλ1为物质在λ1波长下吸光度
　　ελ1为待测物质在波长λ1的摩尔吸光系数
　　ελ2为待测物质在波长λ2的摩尔吸光系数
　　b为光程
　　C为待测物质的浓度
　　双波长紫外可见分光光度计的基本结构
　　图6.双波长紫外可见分光光度计的基本结构图
　　双波长紫外可见分光光度计主要适用于试样的多组分测量，目前国内市场很少采用此类分光光度计。
　　单光束分光光度计和双光束分光光度计的区别
　　一、从测量方式看区别
　　单光束分光光度计是由一束经过单色器的光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行光强度测量的。
　　双光束分光光度计是以两束光一束通过样品、另一束通过参考溶液的方式来分析样品的分光光度计。
　　二、从特点结构看区别
　　单光束分光光度计的特点是：结构简单 价格便宜。
　　双光束分光光度计方式特点是：可以克服光源不稳定性、某些杂质干扰因素等影响，还可以检测样品随时间的变化。
　　三、从精准度看区别
　　单光束分光光度计测量结果受电源的波动影响较大，容易给定量结果带来较大误差。
　　双光束分光光度计结构复杂，可实现吸收光谱的自动扫描，具有较高的测量精密度和准确度。
　　四、从适合分析来看区别
　　单光束分光光度计结构复杂不适于做定性分析。
　　双光束分光光度计特别适合进行结构分析。