液相色谱的常见故障有哪些？如何排除？

　　高效液相色谱 ( HPLC)广泛应用于医药卫生、食品安全、环境化学等各个领域。在使用过程中难免会遇到各种各样的问题，从而影响正常工作，如何快速发现故障、排除故障，并做好预防维护措施及其重要，小析姐列举了常见故障的排除及解决方法，仅供大家参考。
　　压力波动问题
　　1、压力高
　　压力偏高或超过压力上限一般是由方法问题、误操作、系统堵塞、压力传感器故障等问题引起。
　　方法问题： 在方法建立时柱温、流速等参数建立不当，当使用小粒径色谱柱或背压大的色谱柱时，可降低流速或升高柱温（如35～40℃），以降低系统压力，该问题多发生在建立方法时。
　　误操作： 当压力高于平时压力时首先检查柱温是否设置错误、流动相溶剂是否使用错误（如错将甲醇用成了粘度高的乙腈）、色谱柱是否拿错等误操作。
　　系统堵塞： 排除方法问题及误操作后，排查是否系统堵塞，进行分段排查，可依次松开管路接头，从HPLC出口端开始，向上游泵逐个检查，这是发现堵塞部位最简单的方法，确定堵塞部位后可进行直接更换（如安捷伦的过滤白头等）、或超声清洗（如waters的在线过滤器等）、或反冲（如六通阀、进样针、针座、管路等部位），如超声清洗或反冲无效则需更换，经排查是保护柱或色谱柱堵塞时按相关方法冲洗。
　　压力传感器故障： 上述排查后未发现压力高原因，则需要更换压力传感器，联系仪器客服咨询。
　　2、压力低
　　压力偏低或无压力一般是由误操作、漏夜、泵不输液等问题引起。
　　误操作： 泵关闭、打开了排空阀等误操作引起无压力、柱温设置错误、用错溶剂、用错色谱柱等误操作可能导致压力偏低或偏高。
　　漏夜： 压力偏低或无压力很多时候是由漏夜引起，配有漏夜感应器先确认哪个模块漏夜报错（此时已经严重漏夜），清除错误后重新启动泵排查该模块漏夜位置（用滤纸或纸巾逐个接口试漏），未配有漏夜感应器或轻微漏夜时由泵至检测器逐个接口排查（漏夜多发生在色谱柱接口及泵各接口）。确定漏夜位置根据漏夜原因进行处理，如接口松动重新拧紧、如密封圈磨损更换密封圈等。
　　泵不输液： 流动相走空、管路中有空气、未充分排空、溶剂入口过滤头堵塞、单向阀污染均可能引起泵不输液。首先检查溶剂瓶内是否有溶剂、管路中是否充满气体，进行排空（如排空废液口无液体流出使用注射器手动抽，至有连续液体流出）；排空后依然无压力、压力偏低或压力波动，且废液口无废液流出，超声清洗单向阀或更换单向阀，无改善将溶剂入口过滤头取下，查看压力是否正常，如滤头堵塞超声清洗或更换（注：安捷伦溶剂入口过滤头为陶瓷材质，不可以超声，使用1%～10%硝酸浸泡过夜）。  保留时间变动
　　如果所有峰（色谱峰）的保留时间均发生了变化，其原因很可能是流动相的组成、色谱柱的化学性质、色谱柱的温度或流速、在线混合时比例阀故障等。
　　1、流动相的组成
　　如果操作人员操作不当，则会导致流动相组成的意外变化，例如使用在线式混合系统时，流动相混合物（系统）设置不正确；或替换新批次流动相时，未妥善制备新的流动相（新流动相配制不正确）。在极少数情况下，会出现流动相组分选择性损失的情况，例如蒸发。
　　当流动相发生变化时，峰形（色谱峰）通常会向相同的方向移动，以缩短或延长保留时间（保留时间变长或变短）；而相对保留通常会发生变化。检查流动相组成错误的最佳方法是仔细检查（复查）系统设置；如有必要，应制备新的流动相。
　　2、色谱柱化学（化学性质）变化
　　一般会在色谱柱使用数周或数月内逐渐变化。柱老化一般伴随着柱背压的上升、保留时间的逐渐变化（漂移）（更长或更短）以及更多的峰拖尾。更换新柱以确定是否是柱老化导致的保留时间变动。
　　3、色谱柱温度变化
　　柱温变化会导致保留时间的变化，每1℃的温度变化会引起1-3％的保留时间变化。如果不使用柱温箱（即＂室温＂条件），实验室温度通常会变化。尤其是当供暖或空调通风口直接吹向系统时，温度变化极为明显。使用柱温箱可以避免色谱柱出现这样的温度问题，且HPLC系统应远离通风口放置。
　　4、流速变化
　　可能是因存在气泡、泄漏或泵问题（故障）导致流速与设定值发生变化，导致保留时间变化。
　　5、气泡问题
　　可能伴有柱压过低或柱压波动，且保留时间延长。对于双头泵，如果只有一个泵头存在气泡，则流量和压力可能会发生脉动。
　　6、泄漏也会延长保留时间
　　查看接头如有液滴或结晶析出，可证明有泄露。请特别注意色谱柱之前的接头。如果使用不锈钢配件，通常将接头螺母手动拧紧，再扳手拧紧1/4圈，便可以阻止泄漏。使用PEEK接头时，应停止泵，松开接头，将管路推到接口端口的底部，再拧紧接头。拧紧PEEK接头时如果存在流动的液体，会导致管道在配件中滑动，产生柱外死体积，进而影响分离效果。
　　7、单向阀污染或泵密圈磨损会导致流量偏低或波动，从而导致保留时间变化
　　单向阀污染可以进行超声清洗，随着使用时间的增加，泵密封圈会出现磨损，而且使用高浓度缓冲盐为流动相，会缩短泵密圈的使用寿命，可以根据使用情况及密封圈故障率定期更换密封圈，通常一年更换一次即可。
　　色谱峰问题
　　1、拖尾峰
　　（1）筛板阻塞 ：柱子两头的过滤筛板如果堵塞，样品就会在筛板部分受阻而形成时间延迟，使得样品在柱后流出时峰型形成拖尾。需要通过反冲色谱柱，或者更换筛板。
　　（2）色谱柱塌陷 ：是指色谱柱由于其它原因引起了柱效率丧失，不能对物质形成保留，使得物质不在固定相上保留而随流动相流出，但是又还有一点柱效，因此形成拖尾。需要重新填充色谱柱或者更换色谱柱。
　　（3）有污染 ：即样品不在同一起跑线起跑，从后面开始跑得到达终点稍晚，表现出拖尾。更换色谱柱或者采用有机溶剂梯度洗脱1h以上，以冲洗柱子。
　　（4）流动相PH值选择错误 ：如某PH下有的样品存在分子型和离子型的动态平衡，离子型的陆续向分子型转化就会表现出拖尾。调节PH值可抑制分子解离，改善拖尾，对于碱性化合物，相对较低的PH值更有利于得到对称峰。
　　2、前沿峰
　　（1）样品过载 ：被保留的样品在正常出峰时间前陆续出来，形成前沿峰。降低样品含量。
　　（2）样品溶剂选择不恰当 ：当样品溶剂的洗脱能力大大强于流动相时会出现前沿峰，例如，在反相色谱中用已腈做样品溶剂，而流动相的洗脱力较弱时会出现前沿峰。选择流动相或者接近流动相的比例作为样品溶剂。
　　（3）色谱柱损坏 ：色谱柱柱效损失，不能对物质形成保留。更换色谱柱。
　　（4） 在大峰前有小峰出现，假象前沿峰，即大峰前包埋了没有分开的小峰。调整流动相洗脱梯度。
　　3、倒峰
　　（1）样品折射率小： 示差折光检测器测的信号是折射率，出现倒峰的原因是组分的折射率小于流动相。
　　（2）密度的原因： 密度不一样，出来的峰正倒不一样。
　　（3）进样所致： 进样时，样品对原有流动相产生瞬间阻断，然后瞬间涌流，所以产生先倒后高的＂溶剂峰＂。
　　（4）基本不可避免： 试着使用与流动相相同的溶剂作为溶样溶剂，另外进样之前注意平衡跟冲洗参比池。倒峰基本上不能避免，但是这样操作会小些。
　　4、包裹
　　（1）色谱柱问题： 色谱柱流失，柱子被污染。
　　（2）样品溶解度差： 温度可能会影响到溶解度。
　　（3）流动相不均匀： 一般是流动相没配好，管路流动相不均匀，也会导致上述现象。
　　5、基线漂移
　　（1）柱温波动 ：即使是很小的温度变化都会引起基线的波动，通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。使用柱温箱，控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器。
　　（2）流动相不均匀 ：流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。使用HPLC级的溶剂，流动相在使用前进行脱气处理。
　　（3）流通池被污染或有气体 ：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸(不要用盐酸)。
　　（4）流动相配比不当或流速变化 ：更改配比或流速，为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
　　（5）样品中有强保留的物质 ：以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。
　　6、出现宽峰
　　（1） 色谱柱污染或失效 ，造成塔板数降低：更换同样类型的色谱柱，如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。
　　（2） 柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大 ：更换内径较小的短管路。
　　（3） 检测器对反应时间或池体积响应过大 ：减少响应时间或使用更小的流通池。
　　7、基线噪音
　　（1） 在流动相、检测器或泵中有空气(尖锐峰) ：流动相脱气，冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
　　（2） 漏液 ：检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。
　　（3） 流动相混合不完全 ：用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂。
　　（4） 温度影响(柱温过高，检测器未加热) ：使用柱温箱，减少温度差异或加上热交换器。
　　（5） 在同一条线上有其他电子设备(偶然噪声) ：断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。采用精密级稳压电源。
　　8、分离度不够
　　（1）流动相梯度洗脱设置不合理 ：优化梯度洗脱程序。
　　（2）流动相污染或变质(引起保留时间变化) ：重新配置流动相。
　　（3）保护柱或分析柱阻塞 ：去掉保护柱进行分析，如果必要则更换保护柱；如果分析柱阻塞，可进行反冲；如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序；如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。  漏液问题
　　1、接头处漏液
　　接头处漏液一般发生在色谱柱接头处，此处的漏液现象比较直观，一般是液体积流在色谱柱头，造成压力波动。通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题。但值得注意的是过份拧紧会导致金属接头的漏液和塑料接头的磨损。
　　如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题，就必须将接头取下，检查是否损坏(例如，卡套损坏、密封表面有杂质)；损坏的接头应该更换掉。
　　参考下表：
　　2、进样阀漏液
　　（1）转子密封圈磨损太厉害或者损坏，造成密封不严。拆下六通阀，检查转子密封圈，可单独购买，根据说明书自行安装更换。如果定子磨损比较严重的话，有必要也需更换。
　　（2）废液管产生虹吸或者堵塞，造成废液逆流。此时需要保持废液管高于废液液面，或者更换、疏通废液管，保证废液排放正常。
　　（3）进样口密封松动或者进样针头尺寸不合适。需要调整进样口的密封圈或者更换合适的进样针头。
　　具体方法：
　　3、泵漏液
　　泵头漏液一般都是由于密封不好引起的，需要检查相关接口处的密封状况。
　　（1）单向阀、接头松动。这是首先要排查的项目，但单向阀和接头也不能拧得过紧，避免磨损。
　　（2）柱塞杆磨损刮伤或者柱塞密封垫损坏导致的柱后漏液，这是最常见的问题，此情况一般会出现以下三种现象，一是柱塞杆磨损导致与密封圈之间有微小缝隙;二是柱塞杆与密封圈不匹配;三是泵头紧固螺钉没有拧紧。在确定拧紧的情况下，需要更换柱塞杆或柱塞密封垫。
　　（3）比例阀损坏。首先检查手紧接头，如有损坏，则立即更换;再检查隔膜，如果发现漏液则立即更换。
　　具体方法：
　　4、检测器漏液
　　（1）流通池垫片损坏，造成漏液。在使用过程中避免过大的压力，拆开流通池，检查垫片，损坏严重时需要更换垫片。
　　（2）废液管破裂。在人为外力的作用下，废液管受到挤压造成破裂，打开检测池，检查管路，如果破裂，需更换。
　　（3）流通池阻塞。当流通池阻塞时，其内部压力升高，可能会造成池子窗口破裂，此时需要清洗流通池，有必要时需要更换流通池或者池子窗口。
　　具体方法：
　　5、色谱柱漏液
　　流动相常见问题
　　1、流动相脱气不充分
　　流动相受热，或者流动相不同组分混合时会有气体产生，气泡进入泵内引起压力波动，增加噪音，色谱图上出现毛刺。可试用下列方法解决问题：流动相再脱气；采用更有效的脱气方法或两种方法配合使用；改系统内混合为系统外预混合。
　　2、流动相供给不畅
　　流动相用完，管道中吸入气体引起泵压力不稳。应经常观察储液器中流动相的量，加足流动相保证所有的样品分析完毕。输液管道上装沉子沉至瓶底，储液器盖上留一小孔正好夹住进液管，使其不能上下移动。
　　过滤器阻塞引起管道和泵腔空化，压力不稳。过滤器被微粒所阻塞或长霉，去掉过滤器后如果系统运转正常，说明已找出问题，换上新的过滤器则可。有时候换上新的过滤器仍然不畅，那就需要查查流动相的制备过程，或者换大孔径的过滤器。不管如何，流动相都需要重新过滤。
　　流速过高、阻力大，造成空化现象，这是由于过滤器孔径、管道内径、流速和溶剂黏度等引起的。如果流速大于10mL/min，常会出现这种现象。
　　使用下列方法解决：
　　（1）使用低流速；
　　（2）换大孔径的过滤器；
　　（3）增加进液管道内径；
　　（4）抬高或加压储液器；
　　（5）不用过滤器，但流动相一定要先过滤；
　　（6）储液器盖子太紧，在储液器内形成真空，打出的流动相不连续。应松开盖子或留有1mm的缝隙；
　　（7）进液管道阻塞或弯曲使泵抽不到液，注意调整进液管道或更换新的。其它问题包括渗漏或接头松动、泵部件损坏等，都能引起供液不正常。
　　3、流动相和储液器被污染
　　由于污染，噪音越来越大，检测器基线上升。污染物可能被泵以稳定的浓度打入系统，而再以稳定的浓度流出来，所以在色谱图中不出多余的峰。用梯度洗脱时弱流动相可以使污染物聚在柱顶，流动相强度增加后污染物可能被洗脱出来一个大的伪峰。有时基线噪音突然增大或突然提高，都是因为反复加进新的流动相或系统用得太久（通宵）所造成的。新加进的流动相有污染物或者流动相长霉，繁殖了细菌。
　　脏的储液器会污染清洁的流动相。每种流动相备有专用的储液器，或者定期报废储液器。
　　4、流动相污染来自这几个方面：
　　试剂质量不高，玻璃器皿不合格；
　　微生物的影响；
　　配制流动相时操作不当等；
　　因此要求高纯度化学试剂和HPLC级溶剂；
　　玻璃器皿按规定清洗干净；
　　为防止微生物生长，每天要用甲醇清洗系统；
　　怀疑系统内生长了微生物，可用稀硝酸冲洗即可（注意不要损坏柱和管道系统）；
　　真空脱气时防止泵油带入流动相；
　　用清洁的惰性塞子、搅棒、过滤器和玻璃器皿配制流动相；
　　已经污染的流动相一定要废弃掉。
　　许多液相色谱的故障是可以通过日常维护避免的， 所以，做好液相色谱的日常维护，才是解决液相色谱常见故障的法宝。