NatureFood人造肉新进展!
细胞农业发展可以满足人类对动物产品日益增长的需求,但是产量低且监管机构限制用于培养肉生产的基因改造操作。近日,来自 耶路撒冷希伯来大学的Y. Nahmias教授团队进行了鸡成纤维细胞自发永生化产生稳定、高产细胞系,用于无血清生产培养肉的相关研究。 研究成果以"Spontaneous immortalization of chicken fibroblasts generates stable, high-yield cell lines for serum-free production of cultured meat"为题于2022年12月22日发表在《Nat. Food》上。
图1 鸡胚胎成纤维细胞的自发永生化
从肉鸡Ross 308和以色列Baladi鸡的受精胚胎中分离出初级鸡胚成纤维细胞(CEF)。 分离出的细胞在分离后30天内表现出成纤维细胞特有细长、纺锤形形态,随着培养进行,加倍时间从25小时增加到150小时。分离的成纤维细胞在分离后30至70天左右达到危机,CEF-2和CEF-4系加倍时间分别增加到504小时和462小时。纺锤体形态在衰老过程中消失,细胞体积增大并积累特征性空泡。 2-5%的分离物发生突破,导致增殖菌落形成。增殖的成纤维细胞加倍时间在分离后70天稳定在20±2小时,通过群体倍增100的细胞被定义为永生化细胞系,并标记为HUN-CF-2和HUN-CF-4,分别代表来自肉鸡Ross 308和以色列Baladi鸡的细胞系。 原代(CEF-2)和永生化(HUN-CF-2)细胞中的波形蛋白、整合素B1、层析蛋白A/C和层析蛋白B1的免疫染色显示出典型的成纤维细胞特征。
图2 单细胞悬浮液中永生鸡成纤维细胞的锚固性生长
间质细胞依赖贴壁生长受到生物反应器表面积限制,导致产量低下。为使细胞系适应不依赖贴壁生长,研究人员开发了一个管道,用于选择能够作为单细胞悬浮液生长的永生化细胞。 将永生化细胞播种在AggreWellTM板上,形成非粘附性球状体。将球状体分离并转移到振动瓶中,由于剪切应力抑制依赖锚定细胞的增殖,导致对悬浮适应性克隆的选择。并在培养90天后逐渐变成单细胞。表现出稳定增殖的悬浮适应性鸡成纤维细胞(SCF)被命名为FMT-SCF-2和FMT-SCF-4。 接着为两个细胞系建立主细胞库和工作细胞库。使用RNA-seq分析,显示永生化品系聚集在一起,不分品种。将每个品系与原始细胞源进行比较,显示出相似数量的差异表达基因和74%的重叠基因。富集分析显示,涉及细胞基质(ECM)-受体相互作用、焦点粘附、DNA复制、同源(FMT-SCF-3和FMT-SCF-4)的基因显示染色体共同性,进一步表明自发永生的机制。
图3 永生化鸡肉成纤维细胞的遗传稳定性和安全性
为研究细胞系的遗传稳定性,进行RNA-seq和核型分析,P53是基因组稳定性调节器,其目标基因的表达在永生化过程中变化很小。 对FMT-SCF-2和FMT-SCF-4及其各自原代鸡成纤维细胞中的TP53进行了单核苷酸变异(SNV)分析。分析发现在113和402位有两个SNVs。这些变异同时出现在永生细胞系和原代鸡分离物中,因此与永生过程无关,CEF-2和CEF-4在TP53序列中含有额外的SNVs,在永生化过程中丢失,可能是由于克隆选择。为了进一步证明活跃DNA修复,对原代鸡成纤维细胞和永生化细胞进行了彗星试验。数据显示,永生化细胞和原代成纤维细胞之间的DNA修复能力没有明显差异。
为进一步证明细胞系缺乏致瘤潜力,进行软琼脂集落形成试验。两个永生系(FMT-SCF-2和FMT-SCF-4)都没有在软琼脂上形成菌落,证明永生化与致病性转化没有关系,同时其他实验也排除朊病毒或淀粉样疾病的风险。
图4 永生化成纤维细胞转分化为储存脂肪的脂肪细胞样细胞。
肉的香味来自脂肪的氧化。研究人员试图将细胞系转分化为脂肪细胞样细胞。粘附的HUN-CF-2和悬浮适应FMT-SCF-2细胞系在200μM油酸存在的情况下放于rosiglitazone、Pristanic acid和磷脂酰胆碱中。PPARγ诱导产生更圆的细胞核和脂肪细胞的形态。(1)罗格列酮 是噻唑二酮家族的一种PPARγ特异性激动剂,在接触七天后,诱导64%人群中细胞内积聚脂滴。(2)Pristanic acid 是PPARα/γ天然非特异性激动剂,在93%的人群中诱发更均匀的脂滴积累,但细胞形态混合。(3)磷脂酰胆碱 是植物卵磷脂的主要成分,可激活小鼠的PPAR30。磷脂酰胆碱暴露在84%的细胞中诱发了脂滴的强大积累和脂肪细胞样的形态。
图5 培养鸡肉条的制造
在烧烤过程中产生复杂的多芳烃,动物脂肪产生肉类的独特风味和香味。肉的纤维质地通过高水分植物蛋白挤压来模仿。本文开发了一种方法,用培养的鸡肉脂肪浸渍大块高水分挤压大豆蛋白,生产出混合植物和细胞培养蛋白质及脂肪的鸡肉条。 培养鸡和养殖鸡的并排比较显示出类似的纤维横截面和明显的麦拉焦糖化肉质。营养分析表明其营养价值与养殖鸡相似。感官分析在非双盲测试中进行,参与者包括多种族背景,对整体印象、味道、质地、香味和整体体验打分,平均得分是4.5/5。此外两项独立双盲试验显示:强制选择品尝中,参与者将培养鸡肉与大豆基质进行比较。67%的参与者更倾向于培养鸡肉,而不是纹理化大豆基础产品。第二次双盲感官品尝分析,将培养的鸡肉和大豆基地与养殖的鸡胸肉进行比较。参与者对产品与参照物(养殖鸡胸肉)的质地和风味相关属性进行了评价。结果显示,添加培养的脂肪细胞样细胞提高风味相关属性的评分,而没有明显影响产品的质地。
总之,本文利用鸡成纤维细胞的自发永生化和遗传稳定性性能,将细胞系改造成单细胞悬浮液,使用无血清培养基进行培养,卵磷脂激活过氧化物酶增殖剂激活受体γ(PPARγ),诱导永生化成纤维细胞脂肪生成。将培养的脂肪细胞样细胞与挤出的大豆蛋白混合,形成鸡肉条,其中质地由动物和植物蛋白提供,香气和味道则由培养的动物脂肪提供。视觉和感官分析对该产品评分为4.5/5.0,85%的参与者有可能使用该培养肉产品取代食物选择。不经基因改造永生化和高产量生产对实现培养肉市场化至关重要。本研究确定了一条通往可持续生产培养肉的道路,可为未来人类提供更大的食品安全和保障。
文章来源:
https://doi.org/10.1038/s43016-022-00658-w
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