2022年13种单抗首次获批，未来抗体药物开发或将进一步加快

　　抗体药行业是近些年发展十分迅猛的行业，已经在抗肿瘤领域和自身免疫类领域的治疗中占据重要位置；同时在抗病毒和细菌感染，心脑血管，糖尿病以及罕见病治疗等领域也发挥越来越重要的作用，是当前生物药中复合增长率最高的一类药物。
　　2022年，美国或欧盟首次批准的抗体疗法的年度数量与2018年和2021年均达到的13种产品的记录持平，获得批准的13种单克隆抗体的新疗法如表1所示。
　　表1 2022年在欧盟或美国首次获得批准单克隆抗体疗法
　　截至2022年12月31日，有15种抗体疗法的BLA或MAA分别正在接受FDA或EMA的审查（表2) 。2022年批准的抗体疗法的年度数量几乎将达到新纪录，但由于新冠大流行原因，FDA被迫推迟了Toripalimab的BLAs（原定首次行动日期为12月23日） 。不过令人惊喜的是，FDA正在评估用于治疗早期阿尔茨海默病的2种候选产品的BLAs（Lecanemab和donanemab），考虑到该领域大量未满足的医疗需求，这些单克隆抗体的批准有可能改善许多患者 及其护理人员的生活。
　　表2 正在欧盟或美国的监管审查中克隆抗体疗法
　　除美国或欧盟外，其他国家和地区区每年都会出现首次批准单克隆抗体疗法。2022年，有5款单克隆抗体在我国获得首次批准，2款单克隆抗体在日本获得批准。
　　表3 2022年在欧盟或美国以外首次获得批准或正在接受监管审查单克隆抗体疗法
　　目前，中国抗体药物开发市场正处于高速发展的时期，但也面临着许多问题和挑战，如缺少自主知识产权；纯化工艺成本过高；药物质量检测标准不成熟；可能存在重度不良反应；患者的顺应性低等。因此，加强创新、提高核心竞争力，优化抗体药生产工艺等将是中国抗体药物未来的发展方向。
　　过去，工艺强化技术主要集中在上游，增加了下游工艺（DSP）的压力。因此，下游工艺科研人员特别关注单克隆抗体（mAb）捕获步骤。该步骤需要使用有效的特异性蛋白A树脂，才能将单克隆抗体提纯到95%以上，是最昂贵的单元操作之一。但使用此类树脂需要放慢流速，从而导致产量低下。由于产量受到限制，使用蛋白A树脂捕获单克隆抗体经常被描述为下游工艺的瓶颈。模拟移动床或多柱层析等最新技术催生出更加复杂的解决方案，虽然风险管理得以加强，但产量提升有限。
　　膜层析是一种成熟的生物过程技术。它通常用于捕获病毒和病毒载体等大颗粒，以及去除DNA、HCP和病毒的精纯步骤。膜层析的一大特点是产量高。因此，该技术正在重新吸引人们的注意力，以解决强化过程中可能出现的瓶颈。
　　快速循环层析（RCC）与Sartobind®Rapid A配合使用，将彻底变革下游工艺。由于产量可提高10倍以上，选择每批次快速处理还是节省膜消耗量不再无解。快速循环层析（RCC）可消除重复使用树脂带来的生物负载风险，为真正的一次性无柱层析开辟了道路。
　　研究数据表明，与最先进的树脂相比，Sartobind®Rapid A可将产量提高10倍以上，从而解决下游工艺中的瓶颈问题。
　　案例分享
　　该案例调查了Sartobind®Rapid A及其新开发基膜的性能。新基膜结合了对流和扩散传质两种方式。本研究第一部分探讨了动态结合载量与保留时间的关系，并测量了与蛋白A结合的各种含Fc分子的动态结合载量（DBC）。基于这些数据，我们计算出了循环时间和产量。此外，我们还说明了进料浓度和保留时间如何影响产量。
　　材料与方法
　　缓冲液、试剂和单克隆抗体
　　用于缓冲液制备的化学品购自Carl Roth（德国卡尔斯鲁厄），缓冲液成分见表1。
　　表1：用于层析实验的缓冲液
　　蛋白A层析膜
　　所用的蛋白A层析膜是新型Sartobind®Rapid A，膜体积（MV）为1.2 mL。
　　测量动态结合载量（DBC）
　　动态结合载量（DBC）是指在真实实验条件下测得的可装载到固定相上且不会造成不必要损失的最大靶蛋白量。使用Cytiva公司（瑞典乌普萨拉）的ÄKTATM Avant 150层析系统测定层析装置（见前一章：蛋白A层析装置）的动态结合载量（每升膜捕获的单克隆抗体克数）。
　　DBC10%是指在10%穿透时装载的蛋白量（每升膜捕获的单克隆抗体克数）。将纯化蛋白负荷调节至pH 7.0 ± 0.2。平衡装置，然后装载蛋白（进料浓度：CFeed ~1.0 g/L），直到固定相饱和。使用Unchained Labs Little Lunatic（美国普莱森顿）通过离线A280测量来确定进料的确切蛋白浓度。
　　（1）DBC10%=
　　其中，V10%是观察到10%穿透时的体积，V0 =系统空隙体积（L），C0是单克隆抗体浓度（g/L），Vmembrane是层析装置中的膜体积。Sartobind®Rapid A的穿透在保留时间为12秒时测得。
　　确定产量
　　所用层析装置中不同单克隆抗体的纯化产量根据以下公式计算得出：
　　（2）PR=
　　其中，PR [g/L×h]是产量，mmAb[g]是单克隆抗体的平均洗脱质量，Vmembrane[L]是层析装置中的膜体积，tc[h]是整个工艺的平均循环时间。
　　对收获细胞培养液进行蛋白A捕获层析
　　使用Sartobind®Rapid A和AKTATM Avant 150层析系统分别从收获细胞培养液（HCCF）中捕获单克隆抗体。使用表1和表2所示缓冲液和配方进行层析。图 2 所示缓冲液和配方数据可能发生偏差。
　　表2：使用Sartobind®Rapid A捕获单克隆抗体的层析配方
　　1 λ=280 nm时在100 – 100 mAU处收集洗脱峰
　　2 保持至pH值≥12.3，然后添加4 MV
　　3 保持至pH值≤7.5，然后循环结束
　　结果
　　1.与传统层析填料相比，DBC10%与保留时间无关
　　首先，我们研究了Sartobind®Rapid A在10%穿透时的动态结合载量（DBC）及其对不同流量的依赖性，结果是流量不同，单克隆抗体与蛋白A配体结合的保留时间也不同。通过调节不同流量，保留时间从12秒到2分钟不等（见图1）。我们将该数值与两种最先进的蛋白A树脂的DBC10%数据进行了比较[1，2]。如图1所示，当保留时间增加时，Sartobind®Rapid A的DBC10%也随之增加，与扩散限制型树脂相似。
　　在2分钟和0.1分钟保留时间测定的DBC10%分别为50.1 g/L和35.2 g/L。在大约1-2分钟的保留时间内，DBC10%达到最大值区段，而树脂在大约4-6分钟的保留时间内才达到最大值区段。这突出表明，由于Sartobind®Rapid A具备大孔径对流孔，可以用更少的保留时间实现高结合载量。
　　与蛋白A树脂类似，Sartobind®Rapid A也有扩散区域，因此表现出结合载量与保留时间有关。这是由于基于扩散的质量输送是一个缓慢的过程。由于Sartobind®Rapid A使用具备独特性质的新型膜平台，因此与蛋白A树脂相比，DBC10% -保留时间曲线向左偏移。
　　图1 DBC10%与两种不同市售蛋白A树脂和Sartobind® Rapid A保留时间之间的函数关系。
　　注：由于Sartobind® Rapid A使用具备独特性质的新型膜平台，因此与蛋白A树脂相比，DBC10%—保留时间曲线向左偏移。树脂数据取自供应商数据[1, 2]。
　　2.不同单克隆抗体在12秒保留时间下的DBC10%概述
　　接下来，我们测试了多种抗体在10%穿透时的DBC（见图2）。测试抗体包括IgG亚类（IgG1、2和4）以及IgE和Fc融合分子。不同抗体的DBC10%值介于30 g/L和58 g/L之间（见表3）。使用树脂捕获时也可以观察到不同分子的这种DBC10%分布。
　　在12秒保留时间（5 MV/min）下，检测到的DBC10%平均值为43.6 g/L。如图1所示，这些DBC10%值与标准树脂相当，但仅需12秒（0.2分钟）的保留时间即可达到，而树脂则需4-6分钟的保留时间才可达到。
　　图2：不同单克隆抗体在12秒保留时间下达10%穿透时的DBC
　　表3：Sartobind ® Rapid A的DBC10%性能概述
　　3.保留时间对产量和总循环时间的影响
　　根据图1中Sartobind®Rapid A在不同保留时间下测定的DBC10%，计算得出相应产量。图3A显示了保留时间变化对产量的影响。显然，保留时间越短，产量越高；保留时间越长，产量越低。
　　如图3B所示，保留时间增加还会导致总循环时间变长。这意味着在特定时间内可以执行的循环次数减少，从而导致产量下降。但正如下一节所述，这并不意味着应该优先考虑最短的循环时间。
　　图3：(A) DBC10%与Sartobind ® Rapid A保留时间和相应产量的函数关系。(B)上料阶段保留时间对总循环时间的影响。
　　4.进料滴度对产量和总循环时间的影响
　　影响产量的另一个因素是进料滴度。如图4A所示，当进料浓度增加时，循环时间缩短。这是由于与低滴度相比，高滴度的上料阶段较短，因为可以更快达到DBC10%。确定最佳产量必须同时考虑滴度和保留时间，因为这两个因素都会影响循环时间。基于保留时间和DBC10%之间的关系，产量根据流量和产品滴度的函数公式计算得出（见图4B）。产品质量以及达到DBC10%所需的进料量根据 Sartobind®Rapid A的推荐标准配方计算提出，包括每次循环后的再生步骤。
　　图4：(A)进料浓度与循环时间的相对关系。(B)产量与上料阶段不同流量下进料浓度的函数关系
　　图4B表明，对于低滴度进料流（<3 g/L），建议采用10 MV/min的流量来优化产量。对于浓度≥3 g/L的进料流，流量应从10 MV/min降至5 MV/min，以最大限度地提高产量。对于浓度≥8 g/L的进料流，建议将流量进一步降低至3 MV/min。由于流量降低，DBC10%增加，这对产量的影响更大，因为高进料浓度的上料阶段非常短（见图4A）。这表明，如果进料浓度已经很高，则应将重点放在上料时间的优化上，以更好地利用膜的结合载量。
　　综上所述，长保留时间和低流量可以达到最大DBC10%。但两者结合不会自动实现最高产量，如图5所示。当进料浓度为10 g/L时，在3 MV/min条件下的产量最高，为219.4 g/L×h（见表4）。一般来说，随着滴度降低，通过提高流量可以达到最佳效果。具体研究结果见表4。
　　图5：Sartobind ® Rapid A产量与产品滴度和上样期间流量的函数关系。数据点基于内部研究和计算。
　　表4：不同滴度、上料期间流量和DBC10%条件下达到的最高产量
　　讨论
　　Sartobind®Rapid A 采用新开发的对流扩散（convecdiff）膜平台，将树脂典型的高结合载量（扩散限制传质）与纯对流膜的高流量优势相结合，与树脂相比，可以在更短的保留时间内实现高动态结合载量。新型对流扩散膜可以在12秒保留时间内令DBC10%值达到40 g/L以上，而最先进的树脂通常需要4-6分钟的保留时间才能达到类似的DBC10%值。DBC10%与目标分子有关，在保留时间为12秒时，其范围介于30-58 g/L之间。Sartobind®Rapid A的平均DBC10%为43 g/L。由于结合载量与结合位点的可用性、目标分子的大小和其他因素有关，我们也对树脂的DBC10%值范围进行了观察。
　　DBC10%与保留时间的相关性也会影响产量。这正好为使用Sartobind®Rapid A 优化产量提供了机会。
　　以下因素会影响产量：循环时间、进料浓度和动态结合载量（DBC）。假设用于Sartobind®Rapid A的新型对流扩散膜也显示出 DBC 与保留时间的相关性，那么确定以上三个影响因素的最佳组合就可以最大限度地提高产量。对流扩散膜的产量调节试验表明，在低进料滴度条件下，高流量会实现高产量，因为循环时间对产量的影响最大。进料滴度大于3 g/L时，流量在5 MV/min范围内产量最高。高进料滴度（超过8 g/L）导致上料阶段非常短；因此，最好通过提高DBC10%降低流量，以最大限度地提高产量。我们还证明，减少再生频率将有助于进一步提高产量（数据未显示）。然而，再生频率的降低在很大程度上取决于进料条件和污染物水平。这会影响膜的污染程度，并可能缩短其使用寿命。膜污染的第一个迹象是压力增加。膜中的大对流孔和材料的低非特异性结合倾向允许在特定情况下减少再生频率，例如低污染物水平的HCCF。
　　建议优化每种进料的产量，以便在实施过程中充分利用对流扩散膜。高产量可以充分利用膜容量和时间。
　　综上，这种新型对流扩散（convecdiff）膜技术将解决下游工艺中单克隆抗体捕获步骤中存在的技术瓶颈。该膜随即用型设备提供，有助于减少制备填充床层析柱的实际操作时间，并且其循环时间较短，可在同一批次中充分利用其使用寿命。
　　结论
　　Sartobind®Rapid A具备优异的特性和稳定性，为快速循环层析（RCC）提供了解决方案。该方法通过一系列连续的结合和洗脱循环来纯化大量目标成分。在快速循环层析（RCC）模式下，膜吸附器可在同一批次的纯化过程中实现高产量并充分利用膜使用寿命。在同一批次的纯化过程中充分利用膜吸附器的使用寿命是关键，可以克服当前最先进的行业工艺（即填充床层析）缺点。首先，快速循环可缓解蛋白A树脂利用不足的问题，减少大量树脂采购需求，能够以较低成本生产临床材料。其次，使用Sartobind®Rapid A可以显著减少与实际纯化过程相关的非生产性活动（例如，层析柱填料、清洁验证、储存等）。最后也是最重要的一点，Sartobind®Rapid A可以最大限度地降低与填充床层析柱相关的生物负荷风险，因为它不需要在批次之间储存层析柱，也不需要在多个批次中重复使用填充床。
　　参考文献
　　[1]Kaplon H, Crescioli S, Chenoweth A, Visweswaraiah J, Reichert JM. Antibodies to watch in 2023. MAbs. 2023 Jan-Dec;15(1):2153410. doi: 10.1080/19420862.2022.2153410. PMID: 36472472.
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　　卡梅德生物科技（天津）有限公司于2014年成立于中国天津，专注于为全球科学家和研究机构提供高质量的药物抗体发现及其相关配套服务。单克隆抗体具有特异性强，批次间差异小，几乎不存在交叉反应等优点。卡梅德生物可以提供人单克隆抗体制备、小鼠单克隆抗体制备、小分子抗原抗体制备服务，欢迎广大科研用户朋友来咨询。